地奥司明激活JAK2/STAT3信号通路减轻小鼠脑缺血再灌注损伤的实验研究

目的：缺血性脑血管病因高发病率、高致残率和高病死率严重威胁着人类的生命和健康。缺血后继发性损伤是缺血性脑血管病病情加重的主要原因，其机制主要包括细胞凋亡、炎症反应、氧化应激、线粒体功能异常等，其中细胞凋亡是患者病情进展加重及影响预后的重要因素，寻求有效的手段抑制凋亡，改善神经功能缺损，是当前医学研究的重点。尽管细胞凋亡的调节机制并不十分清晰，但最近的实验研究和临床观察显示：抗凋亡蛋白Bcl-2与凋亡前蛋白Bax的平衡在调节凋亡中具有关键作用。大量研究表明Janus activated kinase-2（JAK2）/signaltransducer and activator of transcription-3（STAT3）信号通路的激活能够降低Bax/Bcl-2的比值，减少脑梗死后凋亡细胞数量，减小脑梗死体积，发挥脑保护作用。近年来，关于致病机制的研究取得了很大进展，但有效治疗药物仍不足。地奥司明（Diosmin）是一种微粒化纯化的黄酮类化合物，研究发现地奥司明在慢性静脉功能不全、肝缺血再灌注损伤、糖尿病、癌症等疾病中具有抗凋亡、抗炎等作用，而地奥司明在脑缺血中的作用及机制罕见报道。本实验在小鼠短暂性大脑中动脉阻塞（transientmiddle cerebral artery occlusion，tMCAO）所致脑缺血再灌注模型上，观察局部脑缺血损伤后大脑皮层JAK2，phosphorylated JAK2（pJAK2），STAT3及phosphorylated STAT3（pSTAT3）的动态表达，并研究地奥司明在脑缺血/再灌注急性期的保护作用及其对JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3、Bcl-2及Bax的影响。 方法：采用成年健康雄性CD-1小鼠，应用改良Longa线栓法建立小鼠右侧tMCAO模型。实验一：动态观察脑缺血再灌注后不同时间点JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3的表达，实验分为正常对照组、缺血再灌注后3h、6h、12h、24h、48h、72h六个时间点组。实验二：测定脑缺血再灌注后地奥司明的神经保护作用，实验动物随机分为假手术组（Sham）、tMCAO组、Vehicle组（tMCAO+10%乳糖）、地奥司明小剂量组（Vehicle+Diosmin50mg/kg，DM-L）、地奥司明大剂量组（Vehicle+Diosmin100mg/kg，DM-H）。溶剂对照组和药物干预组动物分别预给药（灌胃）6天，每天一次，于末次给药后1小时行短暂性右侧大脑中动脉栓塞术。tMCAO组和Sham组同样方法灌胃但给予等容量生理盐水。术后24h对小鼠进行神经功能评分，评分完毕后将动物断头处死，用干湿重法测定脑组织含水量，用2%的2,3,5-三苯基四唑氮红（triphenyltetrazolium chloride, TTC）染色法测定脑梗死体积，用尼氏染色法观察脑组织中的尼氏小体，用免疫组化、western blotting和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）测定JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3、Bcl-2和Bax的表达，采用激光共聚焦技术观察pSTAT3的表达部位。 结果： 1JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3的动态观察：JAK2、STAT3在各组间的表达无明显差异，pJAK2、pSTAT3的表达在脑缺血/再灌注3h后开始升高，并于24h达高峰，72h后开始降低。 2地奥司明对JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3、Bcl-2和Bax表达的影响：JAK2、STAT3在各组间表达无明显变化。pJAK2、pSTAT3在tMCAO组和Vehicle组表达较Sham组增加，地奥司明干预后表达量进一步增多，地奥司明大剂量组pJAK2、pSTAT3蛋白表达及阳性细胞数增多，与Vehicle组相比结果有统计学意义（P <0.05）；脑梗死后Bcl-2蛋白和基因表达及阳性细胞数明显降低，而Bax表达则明显增加，地奥司明大剂量组Bcl-2蛋白和基因表达及阳性细胞数较Vehicle组增多，结果有统计学意义（P <0.05），Bax表达则较Vehicle组减少（P <0.05）；地奥司明小剂量组可上调pJAK2、pSTAT3及Bcl-2的表达，下调Bax表达，但趋势不稳定。 3激光共聚焦：pSTAT3在Sham组少见表达，而且主要表达在神经元胞浆，Vehicle组和DM-H组可见pSTAT3表达增多，以后者明显，而且主要在细胞核表达。 4神经功能评分：Sham组无明显神经功能缺损，而tMCAO组、Vehicle组、地奥司明小剂量组和地奥司明大剂量组小鼠均出现不同程度的左侧肢体偏瘫。Vehicle组与tMCAO组神经功能评分无明显差异，地奥司明大剂量组的神经功能评分明显低于Vehicle组（P <0.05），地奥司明小剂量组与Vehicle组相比，神经功能评分虽有所改善，但差异无统计学意义。 5脑组织含水量测定：脑缺血/再灌注后Vehicle组和tMCAO组脑组织含水量均明显高于Sham组（Sham vs. Vehicle and tMCAO:78.24%±1.71%vs.84.01%±1.12%and84.16%±0.75%，P <0.01），地奥司明大剂量组病变侧脑组织含水量明显低于Vehicle组（DM-H vs. Vehicle:81.78%±1.12%vs.84.01%±1.12%，P <0.01），地奥司明小剂量组病变侧脑组织含水量低于Vehicle组，但差异无统计学意义。 6脑梗死体积（%HLV）的测定：Sham组无梗死灶。Vehicle组和tMCAO组可见明显梗死灶，而且两组间脑梗死体积无明显差异。与Vehicle组相比，地奥司明干预组梗死体积均明显减小，差异有统计学意义（Vehicle vs. DM-L and DM-H:62.06%±4.86%vs.40.42%±6.60%and21.44%±3.77%，P <0.01）。 7尼氏染色：与Sham组相比，tMCAO组和Vehicle组尼氏小体数量明显下降。地奥司明干预能明显增加尼氏小体阳性细胞数，与Vehicle组相比结果有统计学意义（P <0.01），DM-H组变化更明显。 结论：脑缺血再灌注后脑组织中pJAK2和pSTAT3的表达显著升高。大剂量地奥司明可以改善神经症状，减小脑梗死体积，减轻脑水肿，对抗局灶性脑缺血再灌注损伤，具有神经保护的作用。其保护作用可能与激活JAK2/STAT3信号通路，上调Bcl-2的含量，下调Bax的表达有关。