应激刺激后早期药物干预预防大鼠创伤后应激障碍的实验研究

创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder, PTSD)是指突发性、威胁性或灾难性生活事件发生后所出现的个体延迟和长期持续存在的精神或心理障碍,主要表现为病理性再度体验创伤、持续性警觉性增高和回避。因PTSD一般都呈现慢性病程、症状多样和高复发率,使得其治疗面对许多困难,甚至有些人会伴随终生。 PTSD的临床药物治疗主要以选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)为主,此外还有抗抑郁药、典型和非典型抗精神药等,关于药物治疗PTSD已有大量文献报道。迄今为止,如何采用药物有效预防PTSD的研究却少有文献报道,开展药物预防PTSD的研究对PTSD的防治具有重要意义。 本课题以大鼠单一延长结合足底电击刺激(SPS&S)模型为基础,在应激后早期分别给予大鼠不同剂量苯二氮卓类药物阿普唑仑,三环类抗抑郁药米帕明、抗抑郁药米氮平、抗癫痫药卡马西平、吩噻嗪类抗精神药氟哌啶醇和β1肾上腺受体阻滞药美托洛尔,运用电击箱、高架十字迷宫(Elevated plus maze, EPM)、旷场(Open-field,OF)实验、Morris水迷宫(Morris water maze, MWM)等行为学测试方法,观察大鼠的条件恐惧反应、探究能力、焦虑水平、学习和记忆能力的改变,探讨在应激后早期预防性给予上述不同剂量药物预防PTSD发生的可能性,筛选何种药物能够预防PTSD的发生,以及确定预防用药的有效剂量范围和最佳用药持续时间,为临床预防PTSD的发生及用药提供科学依据。 目的: 1.评价在创伤性应激刺激后早期预防性给予不同类别、剂量的药物对大鼠的条件恐惧、探究能力、焦虑和学习记忆能力的影响,筛选出预防PTSD的有效药物。 2.探讨药物预防PTSD的有效剂量范围和最佳用药持续时间。 方法: 1. PTSD动物模型——SPS&S模型的建立 由第四军医大学实验动物中心提供八周龄SD大鼠16只,每笼4只,分笼饲养。光亮/黑暗周期为12/12 h,环境温度为(22-25)℃,适应性饲养1周后大鼠被随机分为:空白对照组和SPS&S组。将SPS&S组大鼠用高强度聚乙烯膜自头部至尾部完全包裹,并用胶带束缚,鼻部附近留3～5个透气孔,连续束缚2 h(期间大鼠头、爪被固定不能移动)。2 h后解除束缚,继之强迫大鼠游泳20 min。大鼠休息15 min后,乙醚麻醉使其丧失意识,待恢复意识后再放入电击箱中接受不可避免性足底电击,然后将大鼠放回饲养笼中不受打扰饲养2周。第14 d在电击箱中测试大鼠的条件恐惧水平,第15 d在OF和EPM中测试两组大鼠的探究行为、焦虑水平,第16-21d在MWM中测试大鼠的空间认知能力,评价SPS&S应激模型的有效性。 2. SPS&S应激后早期不同剂量给药方案 八周龄SD大鼠,随机分为空白对照组,SPS&S组,单纯给药组(给中剂量药物,不应激),应激后小剂量、中剂量和大剂量给药组,每组各8只。依上述应激模型制备方法对大鼠实施应激刺激,应激刺激后当天采用自由饲水方式分别给大鼠饲喂不同剂量阿普唑仑(0.06 mg/kg/d,0.125 mg/kg/d),米氮平(0.375 mg/kg/d, 0.75 mg/kg/d, 1.5 mg/kg/d),卡马西平(9.75 mg/kg/d, 19.5 mg/kg/d, 39 mg/kg/d),米帕明1.95 mg/kg/d, 3.9 mg/kg/d, 7.8 mg/kg/d),美托洛尔(1.56 mg/kg/d, 3.125 mg/kg/d, 6.25 mg/kg/d),氟哌啶醇0.013 mg/kg/d, 0.025 mg/kg/d, 0.05 mg/kg/d),上述药物再结合大鼠体重计算出每只大鼠每天用药量后,将其溶于大鼠饲水中连续饲喂连续饲喂14 d。单纯给药组仅连续饲喂中剂量上述药物14 d,不给于应激刺激,应激对照组仅实施应激刺激,自由饮用不含药物的水。于给药后第14 d观察大鼠的条件恐惧水平,第15 d在OF和EPM中分别评价两组大鼠的探究行为和焦虑水平;第16-21 d在MWM中评价大鼠的空间认知能力。 3. SPS&S应激后早期不同持续时间给药方案 八周龄的SD大鼠,随机分为空白对照组,SPS&S组,单纯给药组(米氮平0.75 mg/kg/d,米帕明3.9 mg/kg/d,不应激),米氮平3 d组(应激,米氮平0.75 mg/kg/d连续3 d),米氮平7 d组(应激,米氮平0.75 mg/kg/d连续7 d),米帕明3 d组(应激,米氮平0.75 mg/kg/d连续3 d),米帕明7 d组(应激,米氮平0.75 mg/kg/d连续7 d),每组各8只。依SPS&S应激模型制备方法对大鼠实施应激刺激,应激刺激后当天采用自由饲水方式给大鼠饲喂剂量米氮平0.75 mg/kg/d,米帕明3.9 mg/kg/d,上述药物再结合大鼠体重计算出每只大鼠每天用药量后,将其溶于大鼠饲水中连续饲喂3、7 d。单纯给药组仅饲喂中剂量上述药物,连续7 d,不给于应激刺激,应激对照组仅实施应激刺激,自由饮用不含药物的水。第3、7 d在OF中分别评价大鼠的探究行为,第4、8 d在EPM中分别评价大鼠的焦虑水平,第5-10、9-14 d在MWM中分别评价大鼠的空间认知能力。 结果: 1.大鼠经SPS&S后对其条件恐惧、焦虑水平、探究行为及认知能力的影响。 在MWM实验中,SPS&S组大鼠的上台潜伏期相比空白对照组明显增加;靶象限穿台次数相比空白对照组明显减少(P <0.05),说明SPS&S应激可以显著损伤大鼠的学习记忆能力。 在高架十字迷宫实验中,SPS&S组大鼠5 min内的开臂进入次数百分比和开臂停留时间百分比相比空白对照组明显减少(P <0.05),说明SPS&S应激可以显著增高大鼠的焦虑水平。 在电击箱中,SPS&S组大鼠3 min内的僵滞时间相比空白对照组明显增加(P <0.05),说明SPS&S应激可以显著增加大鼠条件恐惧。在旷场试验中,SPS&S组大鼠15 min内的水平活动距离相比空白对照组明显缩短(P <0.05),说明SPS&S应激可以显著损伤大鼠的探究行为。 2. SPS&S后早期持续给予大鼠不同剂量苯二氮卓类药物阿普唑仑,三环类抗抑郁药米帕明、抗抑郁药米氮平、抗癫痫药卡马西平、吩噻嗪类抗精神药氟哌啶醇和β1肾上腺受体阻滞药美托洛尔干预预防14 d后对大鼠的条件恐惧、焦虑水平、探究行为及空间学习记忆能力的影响。 MWM实验结果显示,中剂量米氮平、美托洛尔和阿普唑仑组大鼠的穿台次数相比SPS&S组明显增加(P <0.05),表明在应激后早期持续给予中剂量米氮平、美托洛尔和阿普唑仑14 d后可以有效预防SPS&S大鼠空间学习记忆能力的下降。 高架十字迷宫实验结果显示,中剂量米帕明、氟哌啶醇、米氮平、卡马西平和阿普唑仑组大鼠在EPM中开臂停留时间百分比较SPS&S组显著增加(P <0.05),表明在应激后早期持续给予中剂量米帕明、氟哌啶醇、米氮平、卡马西平和阿普唑仑14 d后可以有效改善SPS&S大鼠的焦虑水平。 条件恐惧反应结果显示,中剂量美托洛尔、米帕明、米氮平、氟哌啶醇和卡马西平组大鼠在电击箱中的僵滞时间相比SPS&S组明显减少(P <0.05),表明在应激后早期连续给予中剂量美托洛尔、米帕明、米氮平、氟哌啶醇和卡马西平14 d后,可以有效改善SPS&S大鼠的条件恐惧。 旷场实验结果显示,中剂量米帕明、氟哌啶醇、卡马西平、米氮平、美托洛尔和阿普唑仑均能够显著增加大鼠在旷场中的水平活动距离,说明在应激后早期连续给予中剂量米帕明、氟哌啶醇、卡马西平、米氮平、美托洛尔和阿普唑仑14 d后,可以有效改善SPS&S对大鼠探究行为的抑制。3. SPS&S应激后早期分别连续给予中剂量米氮平和米帕明3、7 d后对 大鼠焦虑水平、探究行为及空间学习记忆能力的影响。 MWM实验结果显示,中剂量米帕明连续用药7 d能够显著增加SPS&S大鼠在靶象限的穿台次数,表明在应激后早期持续给予中剂量米帕明7 d可以有效预防SPS&S大鼠空间学习记忆能力的下降。中剂量米帕明连续用药3 d,中剂量米氮平分别连续用药3 d、7 d后对SPS&S所致大鼠空间学习记忆能力的下降无改善作用。 高架十字迷宫实验结果显示,中剂量米帕明分别连续用药3 d、7 d,中剂量米氮平连续用药7 d,均能够显著增加SPS&S大鼠在EPM开臂中停留时间百分比,表明在应激后早期持续给予米帕明和米氮平可以有效改善SPS&S大鼠焦虑。中剂量米氮平连续用药3 d,对SPS&S大鼠焦虑无改善作用。 旷场实验结果显示,中剂量米氮平、米帕明分别连续用药3 d、7 d,均能够显著增加SPS&S大鼠在旷场中的水平活动距离,表明在应激后早期分别连续给予米帕明和米氮平3 d、7 d后均可有效改善SPS&S大鼠的探究行为抑制,最短有效用药时间为3 d。 结论: 1. SPS&S应激后早期给予亚治疗剂量米氮平、米帕明,能够显著改善SPS&S大鼠的条件恐惧、焦虑水平、探究行为抑制及空间学习记忆能力损伤。卡马西平、氟哌啶醇、美托洛尔和阿普唑仑对SPS&S大鼠的条件恐惧、焦虑、探究行为抑制及空间学习记忆能力损害有改善作用,但不及米氮平和米帕明。 2. SPS&S应激后早期分别持续给予亚治疗剂量米氮平、米帕明3 d可以改善SPS&S大鼠的条件恐惧、焦虑水平以及探究行为抑制,持续给予亚治疗剂量米帕明7 d可以改善SPS&S应激造成大鼠的学习记忆认知损伤。 3.综合评价本研究中所用各类药物的疗效,中剂量米帕明连续用药7 d,在改善SPS&S大鼠的条件恐惧、焦虑、探究行为及空间学习记忆能力等各项指标上,均显示出显著疗效,提示亚治疗剂量的米帕明具有预防PTSD的潜在治疗前景。