蓝桉果实化学成分及质量控制研究

蓝桉为桃金娘科(Myrtaceae)桉属植物，在我国主要分布于广东、广西、云南和四川等地。蓝桉果实(俗称一口钟)在民间具有广泛的应用，主要用于治疗感冒、炎症、跌打损伤以及癌症等疾患。在本课题组前期研究过程里，已对蓝桉果实进行过初步探索，实验结果表明其中总三萜酸(ETA)，在抗黑色素瘤和体外抗肝癌方面药效明确，具有很好的开发前景。本研究在对ETA进行深入研究时，又发现：蓝桉果实中化合物9，结构全新，具有很好的抗肿瘤效果；蓝桉果实富含挥发油。因此，为了开发蓝桉果实系列中药新药，本文在中药现代化思想的指导下，以前期工作为基础，按现代中药新药报批的要求，对蓝桉果实的化学成分、提取工艺、药理药效及制剂制备进行了系统深入的研究。本文分为四部分，研究内容概述如下： 第一部分 化学成分研究 利用硅胶、大孔树脂、sephadexLH20柱层析，共分得9个化合物单体，应用理化常数测定和光谱(UV、IR、MS、1H-NMR，13C-NMR，2D-NMR)分析技术进行鉴定，分别为β-谷甾醇(1)、胡萝卜苷(2)、豆甾醇(3)、槲皮素(4)、山奈酸(5)、熊果酸(6)、白桦脂酸(7)、白桦脂酮(8)、1-(1′-杜香醇)-异戊烷基-2，4，6-三羟基-3，5-苯二醛(9)。化合物3、4、5、9为首次从该植物中提出，其中化合物(9)为结构全新的化合物。 挥发油为蓝桉果实中的一类重要成分，在前期研究中利用溶剂提取法和GC-MS法从挥发油中分离鉴定了17个化合物，本文采用水蒸气蒸馏法对挥发油进行提取，并用GC-MS法从中鉴定了31个化合物：α-松油萜(α-Pinene)、水芹烯(phellandrene)、α-松油烯(α-terpinene)、柠檬精(limonene)、1，8-桉叶素(1，8-cineole)、γ-松油烯(γ-terpinene)、聚花伞素(o-cymene)、蒈烯(carene)、异戊酸异戊烯酯(isovaleric acid isopentyl ester)、芳樟醇氧化物(linaloloxide)、马兜铃烯(aristolene)、异喇叭茶烯(isoledene)、松油醇(terpienol-4)、石竹烯(caryophyllene)、榄香烯(elemene)、胡薄荷醇(pulegone)、长松叶烯(longifolene)、α-松油醇(α-terpineol)、长松针烷(carane)、桉叶醇(eucalyptol)、醋酸香叶醇酯(acetic acid 一一一一一一一一一一一一一一」幻月臼以至生奔至皿」赶久一一一一一— geraniol ester)、香木兰烯(aromaden由ene)、伞柳醇(uxnbellulol)、杜松醇(eadinol)、 愈创木脂醇(guaiol)、蓝按醇(globulol)、按油烯醇(spathulenol)、Y一按叶油醇(Y 一eudesmol)、。一按叶油醇(a一eudesmol)、香芹酚(earvaerol)、隐陡头菌醇(iludol)。 应用氨基酸分析仪对蓝按果实中所含氨基酸进行了鉴定和分析。蓝按果实中 至少含有17种以上氨基酸，以天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、撷氨酸、亮氨酸、 精氨酸等为主，含人体必需氨基酸7种。以1009干燥样品计，蓝按果实总氨基 酸含量合计为4.769，其中人体必需氨基酸为2.1 19(44.3%):游离氨基酸含量 合计为25.29mg，其中人体必需氨基酸为9.3mg(36.7%)。 第二部分总三菇酸(ETA)质量标准研究 前期实验研究结果表明本植物中三菇类成分含量较高，同时具有较好的药理 活性，本文首次对蓝按果实中的总三菇酸(El人)进行了中试提取工艺的研究。 在中试工艺研究中，以白桦脂酮、白桦脂酸、熊果酸为定量指标，通过对乙醇浓 度、乙醇体积、流速、浸泡时间等因素的筛选，建立了ETA的最佳提取流程，从 而达到符合国家中药新药报批要求，为今后的工业化奠定基础。 本文首次建立了紫外分光光度法和高效液相色谱法分别对所制备ETA的总 三菇酸和各活性成分进行含量测定，同时通过鉴别、检查等项目的研究对ETA进 行质量监控，从而保证所提供样品的稳定性、可控性及可重复性，为今后的大生 产提供质量监控手段。 第三部分药理药效研究 采用MT’r法检测ETA对不同肿瘤细胞株体外生长的抑制作用，实验结果表明， ETA对所试肿瘤细胞株的体外生长皆具有一定的抑制作用，其中对肺癌(A549)、 宫颈癌(Hela)、黑色素瘤(B16)、肝癌(HepGZ，SMMC一7721，BEL一7402，BEL一7404)、 结肠癌(LS一174一T，Caeo一2)，胃癌(SGC一7901，AGS)、乳腺癌(MCF一7，SHZ一88， C127)、食管癌(Eca一109)和卵巢腺癌(HO一8910)细胞生长的最大抑制率均达到85% 以上，因此提示ETA具有广谱抑制肿瘤细胞生长作用。 对ETA的抗炎实验进行研究，通过小鼠耳廓肿胀度测定、小鼠腹腔毛细血管 通透性测定、角叉菜胶致大鼠足趾肿胀度测定、棉球肉芽肿增生测定，结果表明 ETA在剂量为Zoom叭g和400m叭g有明显的抗炎作用。 采用体外实验对新化合物(9)进行不同瘤株筛选，结果表明该化合物对人 ~一一一一-一—.一一.1应军城大龚攘玄度盆份久. 肝癌细胞(Huh一7)、人胃癌细胞(AGS)、人食管癌细胞(Eca一1 09)、人肾癌细 胞(786一O)、人肺癌细胞(A549)、人结肠癌细胞(CS一1 74一7)的抑制率分别为 91.75%、91.6%、89.46%、90%、92%、89%;对人口腔癌细胞(KB)、人白血 病细胞(K562)抑制率较低，分别为81 .9%、82.8%。因此化合物(9)有望开 发为抗肿瘤一类中药。 第四部分ETA片剂制备及其质量控制 首次将ETA制成片剂。本部分以自提的ETA为原料，首先采