D-海因酶固定化的初步研究

随着医药工业的发展,D-苯丙氨酸作为一种重要的化工医药原料,其用途不 断拓宽,具有较好的应用前景。目前可采用许多方法来生产 D-苯丙氨酸,其中 尤以海因酶法备受关注,该法具有产物光学纯度高、酶催化活性高等优点。“一 酶一酸法”作为海因酶法的一种改进方法,是利用微生物产生的 D-海因酶水解 苄基海因得到 N-氨甲酰-D-苯丙氨酸(Nc-D-Phe),然后通过酸水解 N-氨甲酰-D- 苯丙氨酸,获得 D-苯丙氨酸。在该法中,由于酸水解反应非常迅速,且产物收 率高(95%以上),故此时酶转化制备中间体 N-氨甲酰-D-苯丙氨酸的过程成了 整个工艺的关键。但目前单批发酵的游离细胞只用一次即行抛弃,而固定化细胞 或酶作为生物催化剂具可多次重复利用、稳定性、操作简单和产物易于分离纯化 等优点。因此利用固定化的方法生产中间产物 N-氨甲酰-D-苯丙氨酸对于促进 D-苯丙氨酸的产业化进程,具有重要意义。 本论文采用固定化方法生产中间产物 N-氨甲酰-D-苯丙氨酸,包括了固定化 细胞载体的选择、聚乙烯醇凝胶固定细胞包埋条件的探索、固定化 D-海因酶载 体的选择和微波条件下 D-海因酶水解苄基海因的探索四个方面。 将用不同包埋材料制备的固定化细胞进行转化实验,通过对各种固定化细胞 的机械强度、酶活回收率及操作难易的综合比较,认为聚乙烯醇复合凝胶是理想 的载体。 通过单因素实验得出聚乙烯醇复合水凝胶制备固定化细胞的最优条件为:凝 胶最佳浓度为 10 %,最适湿细胞包埋量为每毫升凝胶 0.28 g、凝胶强化剂 1%、 甘油浓度 3%、固定化细胞的最适 pH 9.0、最适温度 50℃、固定化细胞的 pH 稳 定性及储存稳定性均高于游离细胞,固定化细胞的半衰期为 15 d。通过对反应前 后的固定化颗粒切片的电镜扫描,推断细胞泄漏可能是固定化颗粒使用过程中酶 活衰退的主要原因。 尝试不同功能基团的树脂及不同的固定化方法,并从酶活回收率、固定化酶 的使用寿命及载体价格等方面综合考虑,认为载体 D92 所制备的固定化酶具有 应用价值。采用该法制备固定化酶的最优条件是:酶浓度 6 mg/mL、吸附温度 I 25℃、吸附时间 12 小时。所得固定化酶的最适作用温度 45℃、最适作用 pH 8.5、 Km’为自由酶的 1.8 倍、且酸碱稳定性、热稳定性、储存稳定性及操作稳定性较 好。 研究了微波辐射辅助的 D-海因酶水解反应,结果发现微波可以加快固定化 酶催化反应速率 20 倍左右,加快游离酶催化反应速率八倍左右。通过优化实验 得出较合理的反应条件:温度 33℃,反应时间 2min,此时的反应产率在 80%左 右,半衰期为 16min。将批次反应实验后酶活降至 50%以下的固定化酶置于 4℃ 冰箱保存 24 小时后,测定其酶活,固定化酶活性可恢复至初始水平。重复实验 5 次后,固定化酶酶活恢复能力开始降低。并从蛋白质分子的结构与活性的关系 来分析和解释这种变性与复性现象。