食品中动物源性成分定性鉴定方法研究

本研究采用高度特异引物PCR法、基因条形编码法（DNA barcoding）、限制性内切酶酶切片段长度多态性法（PCR-RFLP）、通用引物-聚合酶链式反应-限制性片段末端长度多态性法（UP-PCR-TRFLP）对食品中猪、牛、羊源性成分进行检测,比较四种方法各自的优缺点及适用范围,建立食品中动物源性成分定性鉴定方法。主要研究结果如下: （1）试验证实:基于线粒体DNA（mtDNA）D-loop区和细胞色素b（Cytb）基因设计出的引物具有高度特异性,能够对食品中猪、牛、羊源性成分进行准确的定性检测,且能够检测混合样品。 （2）利用双脱氧法sanger法对COⅠ基因测序并对测序结果进行多重序列比对,发现猪、羊、牛COⅠ基因的碱基差异为19%～25.9%,物种内的碱基差异仅为0.1%～1.6%。COⅠ基因含有大量的具有物种特征的单核苷酸位点,因此,利用猪、牛、羊COⅠ基因的碱基差基因条码技术能够非常准确地鉴定食品中的猪、牛、羊3种动物源性成分,但是受sanger法测序技术的限制,该方法不适于混合样本的检测。 （3）利用PCR-RFLP法对猪、羊、牛3个物种的COⅠ基因进行酶切,经HinfⅠ酶切后均可获得3个物种特征片段长度段,猪的片段长度分别为40bp、411bp、449 bp;牛分别为46p,377bp,479 bp;羊分别为144bp、376bp381 bp。通过电泳检测, PCR-RFLP法能够对食品中的猪、牛、羊3种动物源性成分进行定性鉴定,但不适于混合样品的检测。 （4）采用UP-PCR-TRFLP法在COⅠ基因保守区设计一对牛羊通用引物,并对上游引物的5’端用6-FAM进行荧光标记,在下游引物的5’端用ROX进行荧光标记,然后用限制性内切酶HinfⅠ和BlnⅠ进行酶切消化,再经毛细管电泳建立牛和羊的特有峰谱。牛的PCR产物经过限制性内切酶HinfⅠ酶切后在上游会产生373bp长度的片段,在下游产生46bp长度的片段,这两个片段为牛酶切后的特征片段。羊的PCR产物经过限制性内切酶BlnⅠ酶切后在上游会产生515bp长度的片段,在下游产生203bp长度的片段,这两个片段为羊酶切后的特征片段。不同物种可产生不同的峰谱。因此该法可用于牛、羊肉的定性鉴定分析,且能够用于混合样本的的鉴定。 （5）mtDNA上的COⅠ基因测序分析和限制性内切酶切分析结果均表明:COⅠ基因含有大量能够用于物种鉴定的碱基突变,在猪、牛、羊的物种鉴定中,具有很好的区分鉴别能力,可以应用于食品中动物源性成分的鉴定工作。