苹果、梨铁蛋白基因的克隆及菜豆铁蛋白基因在转基因苹果和番茄植株中的表达特性研究

铁蛋白是一种铁贮藏结合蛋白，广泛存在于植物、动物、微生物中，由24个亚基组成450KD的巨大复合体，可以储藏结合4500个可溶、非毒性、可利用的铁原子，在生物体内铁的代谢方面起着关键作用。 苹果是世界范围内广泛栽培的果树，但目前关于苹果铁蛋白基因的克隆和表达特性的研究却很少。本试验研究了苹果和梨铁蛋白基因和启动子的克隆，以及铁蛋白基因在转基因和非转基因苹果基因组中的表达特性，对转基因苹果基因组中铁蛋白基因表达的影响因素进行了探讨，并利用番茄作为模式植物对外源铁蛋白基因在转基因苹果基因组内的表达进行了预测。 1．根据已报道植物铁蛋白基因(ferritin)的保守区域设计引物，用RT-PCR和RACE的方法从‘嘎拉’苹果(Malus domestica Borkh．cv‘Gala’)叶片中获得苹果铁蛋白基因(MdFer)的全长序列。该基因已被GenBank数据库收录，登录号为DQ099429。该cDNA共含1043个碱基，编码区831bp，编码277个氨基酸残基的蛋白质，终止密码子后有209bp左右的3'端尾随序列区。通过GenBank同源性比对发现，该基因与大豆、豇豆、拟南芥、烟草、小金海棠、小麦、水稻、玉米铁蛋白基因氨基酸序列同源性分别为85％、83％、82％、80％、75％、74％、72％、71％。Southern杂交结果显示，Ferritin基因在‘嘎拉’苹果基因组中至少有7个拷贝存在。0.5mM的柠檬酸铁处理‘嘎拉’苹果试管苗的茎段不同时间后的定量RT-PCR表明，该基因随着诱导时间的延长表达量增加，说明‘嘎拉’苹果的铁蛋白基因在转录水平上受铁诱导表达。同时利用Promoter Walking方法从‘嘎拉’苹果基因组中克隆出MdFer的启动子序列。该启动子序列具有G-box、BlockⅡ、SHS等铁蛋白基因启动子所共有的序列特征，并且在-83—-70bp的位置与ZmFer1启动子的IDRS(Iron-dependent Regulation Sequence)区域同源性较高。 2．根据已报道植物铁蛋白基因的保守区域设计引物，用RT-PCR和RACE的方法从‘翠冠’梨(Pyrus pyrifolia Nakai．cv‘Cuiguan’)叶片中克隆到四种铁蛋白基因的全长序列。这四种基因已被GenBank数据库收录，登录号分别为DQ417207、DQ417208、DQ417209、DQ417210。第一种梨铁蛋白基因PpFer1的全长为795bp，编码265个氨基酸残基的蛋白质，终止密码子后有292bp的3'端尾随序列区；第二种梨铁蛋白基因