调节性T细胞在银屑病中的作用及机制研究

目的明确调节性T细胞(T regulatory cells,Treg)在银屑病发病中作用,探讨Treg细胞参与银屑病发病的关键分子机制。方法收集81例银屑病患者及46例健康人外周血,流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞占CD4+T细胞的比例;分选银屑病患者及健康人CD4+CD25+CD127-Treg细胞和CD4+CD25-CD127+效应T细胞(T effective cell,Teff),利用淋巴细胞共培养模型研究Treg细胞增殖能力及免疫抑制功能;通过表达谱芯片筛选银屑病患者Treg细胞差异基因表达,GO聚类分析关键的信号通路,q PCR和FCM验证表达的差异基因;根据筛选分析结果,q PCR、免疫荧光和Western blot检测银屑病外周血及皮损Treg细胞功能缺陷关键分子Foxo1和AKT的m RNA、蛋白磷酸化水平及细胞内表达定位;利用健康人及银屑病患者血清刺激Treg细胞,免疫荧光和Western blot检测AKT和Foxo1的蛋白磷酸化水平及表达定位;CHIP检测Foxo1和T-bet的启动子区结合情况;Foxo1 sh RNA转染健康人Treg细胞,淋巴细胞共培养检测Treg细胞的增殖能力及免疫抑制功能,FCM检测Treg细胞中T-bet和IFN-γ表达水平;利用T细胞回输联合咪喹莫特(Imiquimod,IMQ)诱导Rag2-/-小鼠银屑病样模型,研究Treg细胞在银屑病发病中的作用;分选Foxo1敲除小鼠和WT小鼠的Treg细胞,利用T细胞回输联合IMQ诱导Rag2-/-小鼠银屑病模型,明确Foxo1在Treg细胞参与银屑病发病中的作用。结果银屑病患者外周中Treg细胞占CD4+T细胞比例与健康人相比无明显差异(P=0.1365);且与银屑病严重程度呈正相关性(R2=0.2580,P<0.001);银屑病患者Treg细胞的增殖能力明显降低,其抑制Teff细胞活化能力也明显低于健康人Treg细胞;表达谱芯片结果显示银屑病患者外周血中Treg细胞表达大量以IFN-γ为主的促炎因子,将银屑病患者Treg细胞的基因表达谱与Foxo1-/-Treg细胞的表达谱比对,发现Foxo1-/-Treg细胞中60%的基因表达变化趋势与银屑病患者Treg细胞的基因表达谱一致;q PCR检测结果发现银屑病患者Treg细胞中Foxo1的m RNA水平与健康人相比无明显差异,介导Foxo1磷酸化的AKT的m RNA水平明显高于健康人,Western blot结果显示银屑病患者Treg细胞中AKT磷酸化水平升高,同时Foxo1的Thr24位点磷酸化水平明显升高,Foxo1总量表达明显降低;免疫荧光结果显示,健康人Treg细胞中Foxo1主要表达在胞核内,而银屑病患者Treg细胞中Foxo1大量向胞浆迁移;血清刺激实验中发现,与健康人血清相比,银屑病患者血清能够明显抑制Treg细胞的免疫抑制功能,增加AKT的磷酸化水平,促进Foxo1向胞浆迁移,使其失去转录活性;CHIP的结果发现Treg细胞中Foxo1可以和T-bet的启动子区相结合;利用Foxo1sh RNA抑制健康人Treg细胞中的Foxo1表达,能够明显抑制Treg细胞增殖能力及免疫抑制功能,促进Treg细胞表达T-bet和IFN-γ;银屑病小鼠模型显示,局部回输Treg细胞能够明显缓解小鼠银屑病样皮损的严重程度,而局部回输Foxo1-/-Treg细胞则不能有效缓解实验小鼠银屑病样表型。结论我们的研究明确了银屑病存在Treg细胞功能缺陷,并证实其在银屑病发病中发挥重要作用;发现银屑病患者异常的免疫微环境造成Treg细胞中AKT介导的Foxo1磷酸化水平升高,促进Foxo1向细胞浆迁移,使其转录活性降低,导致Treg细胞功能缺陷。本研究首次证实Foxo1磷酸化是Treg细胞功能异常及影响银屑病发病的关键分子机制。