花生白藜芦醇合酶基因的克隆及原核表达

白藜芦醇(三羟基反式芪)存在于少数几种植物中，是一种植物抗毒素，同时药理学的研究表明，它具有抗癌抗心血管疾病等生理活性。白藜芦醇合酶是催化合成白藜芦醇的关键酶，对该酶及其基因的研究既有助于更深入地了解该酶的催化合成机理，又有助于进行转基因提高其它作物的抗病性。 本实验的目的是从花生中克隆白藜芦醇合酶基因，并在大肠杆菌中表达该基因，为以后开展转基因工作以及探索酶的功能的工作奠定基础。 本实验使用反转录PCR(RT-PCR)的方法，从花生中提取mRNA，反转录为cDNA，利用白藜芦醇合酶基因特异性的引物从中扩增出目的基因。将目的基因克隆到T-载体pMD-18T上，送检测序。结果表明，目的基因的长度为1170bp，编码390个氨基酸，与Genbank中已有的几个花生白藜芦醇合酶基因的氨基酸序列的相似性为93％-96％。 将目的基因亚克隆到表达载体pQE30-a上，转化到大肠杆菌M15中，经测序表明，目的基因序列及读码框均正确，表达载体构建成功。用IPTG诱导重组菌，目的蛋白表达量达到菌体总蛋白的24％，超声波破碎菌体，收集可溶蛋白，用组氨酸亲和柱纯化目的蛋白，SDS-PAGE电泳得到单一的目的条带。 本实验成功获得花生白藜芦醇合酶基因，并在大肠杆菌中实现了大量表达。