目的
通过检测膝骨关节炎(Knee Osteoarthritis, KOA)患者和正常人关节液中基质金属蛋白酶(MMP-1、-3、-8、-13)、金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)的含量,探讨MMP-1.-3.-8.-13.TIMP-1与膝骨关节炎严重度指数和X线等级之间的关系,寻找膝骨关节炎早期诊断、病情评估的生物学指标。
通过调查KOA患者中医证侯特征、关节液理化性状、X线分级、Lequesne膝骨关节炎严重度指数,探讨关节液理化性状、X线等级、严重度指数、MMP-1.-3.-8.-13. TIMP-1等指标与中医证型的相关性,为KOA中医辨证分型提供客观依据,为中医证侯研究提供新思路和新方法。
观察KOA大鼠关节冲洗液中MMP-1.-3.-8.-13.TIMP-1含量及关节软骨退变严重程度,探讨这些指标与关节软骨退变的相关性,进一步验证临床研究中的有关结论。
方法
1.文献研究查阅国内外有关KOA方面的文献资料,回顾KOA的中医病名、辨证分型及流行病学研究,概述KOA的发病机理,以及基质金属蛋白酶及金属蛋白酶组织抑制因子在KOA方面的研究进展,分析国内有关KOA中医证型客观化的研究现状。
2.临床研究根据KOA的诊断标准、中医证型分类标准,制定KOA的临床调查表。选择广州中医药大学附属广东省第二中医院骨科门诊和病房KOA患者78例进行研究,3例患者因未能抽出关节液,不纳入研究内。调查内容包括患者的一般情况、中医证侯特征、关节液理化性状、X线特点、Lequesne膝骨关节炎严重度指数等；同时收集75例KOA患者和10例正常人的关节液,用酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)测定关节液中MMP-1.-3.-8.-13.TIMP-1含量。运用现代统计学方法,探讨这些客观指标与中医证型的相关性。
3.实验研究将32只清洁级SD大鼠分为假手术组、手术组4W、手术组6W、手术组8W,共4组,每组8只,雌雄各半,手术组采用改良Hulth造模法。分别于4W、6W、8W处死,观察各组大鼠膝关节X线特征；肉眼观察关节软骨情况；镜下观察关节软骨退变情况,进行Mankin评分；免疫组化检测关节软骨中MMP-1、-3、-8、-13蛋白表达情况；ELISA法检测关节冲洗液中MMP-1.-3.-8.-13.TIMP-1含量。探讨关节冲洗液中MMPs. TIMP-1的含量与软骨退变的相关性。
结果
1.文献研究
膝骨关节炎发病机理复杂,基质金属蛋白酶及组织抑制因子在膝骨关节炎关节软骨基质降解过程中有着重要作用。中医认为膝骨关节炎属于“痹症”,肝、肾、脾虚是疾病的内因,风、寒、湿、热、痰、瘀是疾病的外因,本虚标实是疾病的基本特征。免疫细胞因子和炎症介质等客观指标与KOA中医证型有一定的相关性,说明中医证型的客观化研究具有可行性。
2.临床研究
调查KOA患者75例,其中肝肾不足、筋脉瘀滞型32例(42.67%),脾肾两虚、湿注骨节型21例(28.00%),肝肾亏虚、痰瘀交阻型22例(29.33%)。
三组中医证型患者的体重指数、身体肥胖情况、职业特点比较,P>0.05,差异无统计学意义。病程与中医证型经Logistic回归分析,肝肾不足、筋脉瘀滞型相对于脾肾两虚、湿注关节型,P=0.623>0.05,没有统计学意义；肝肾亏虚、痰瘀交阻型相对于脾肾两虚、湿注关节型,P=0.036<0.05,差异有统计学意义。
三组中医证型患者关节液的颜色比较,P=0.966>0.05,差异无统计学意义；而透明度和粘稠度比较,P<0.05,差异均有统计学意义。
三组中医证型患者的X线等级分布比较,经秩和检验P<0.05,差异有统计学意义；三组患者膝骨关节炎严重度分布比较,经非参数统计P<0.05,差异有统计学意义。
正常人关节液中均未检测到MMP-8、-13；75例患者关节液中均可检测到MMP-1、-3、TIMP-1:其中10例检测到MMP-8,21例检测到MMP-13。三组不同中医证型患者关节液中MMP-1、-3、TIMP-1、MMP-1/TIMP-1、MMP-3/TIMP-1与正常人比较,P<0.05,差异有统计学意义。
关节液中MMP-1、MMP-3、TIMP-1、MMP-1/TIMP-1、MMP-3/TIMP-1与X线等级的相关性经logistic回归分析,P<0.01,四个等级的各个指标在差异均有统计学意义；按MMP-1、-3、MMP-1/TIMP-1、MMP-3/TIMP-1高低次序排列：Ⅳ级>Ⅲ级>Ⅱ级>Ⅰ级；按TIMP-1含量高低依次排列：Ⅲ级>Ⅱ级>Ⅰ级,Ⅳ级略低于Ⅲ级。
关节液中MMP-1、-3、TIMP-1、MMP-1/TIMP-1、MMP-3/TIMP-1与膝骨关节炎严重度指数的相关性经logistic回归分析,MMP-1、TIMP-1在膝骨关节炎严重度四个等级之间的差异有统计学意义(P严重>中度>轻度。MMP-3、MMP-1/TIMP-1、MMP-3/TIMP-1在四个等级中差异无统计学意义(P>0.05)。
不同中医证型患者关节液中MMP-1含量比较,各组间差异均有统计学意义(P<0.05)。MMP-3、TIMP-1、MMP-1/TIMP-1、MMP-3/TIMP-1比较,肝肾亏虚、痰瘀交阻型与其他两型比较,差异有统计学意义(1,<0.01)：脾肾两虚、湿注骨节与肝肾不足、筋脉瘀滞型型比较,P=0.176,0.069,0.106,0.208>0.05,差异无统计学意义。
3.实验研究
关节冲洗液中均可检测到MMP-1、-3、TIMP-1。TIMP-1、MMP-1/TIMP-1在手术组4W与假手术组比较(p=0.057,0.053>0.05),差异无统计学意义;其他与假手术组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。随手术后时间的延长,关节冲洗液中MMP-1.-3.TIMP-1.MMP-1/TIMP-1.MMP-3/TIMP-1呈现升高趋势。
关节软骨中MMP-1、-3、-8、-13蛋白表达在手术组4W、6W、8W与假手术组之间比较,差异均有统计学意义(P<0.01)；随手术后时间的延长,关节软骨中MMP-1、-3、-8、-13蛋白表达呈升高趋势。
关节冲洗中MMP-1与软骨MMP-1两个变量间的关系,pearson相关系数r=0.946,P<0.01,差异有统计学意义。关节冲洗液MMP-3与软骨MMP-3两个变量间的关系,pearson相关系数r=0.843,P<0.01,差异有统计学意义。
假手术组和手术组4W关节冲洗液均未检测到MMIP-8、-13；手术组6W只有1例检测到MMP-8,2例检测到MMP-13；手术组8W有3例检测到MMP-8,5例检测到MMP-13。
结论
膝骨关节炎中医证型分布中肝肾不足、筋脉瘀滞型较多见,体重指数、身体肥胖情况、职业特点、关节液的颜色与膝骨关节炎中医证型无明显相关性。
病程、关节液的透明度和粘稠度、X线特征、严重度指数均与KOA中医证型有一定的相关性,可作为中医辨证分型的参考指标。随病程延长,肝肾亏虚、痰瘀交阻型发生率呈上升趋势。在关节液的透明度和粘稠度方面,肝肾不足、筋脉瘀滞型透明度偏清,粘稠度偏高；其次为脾肾两虚、湿注骨节型；肝肾亏虚、痰瘀交阻型透明度偏浑浊,粘稠度偏低。在X线分级方面,肝肾不足、筋脉瘀滞型和脾肾两虚、湿注骨节型多见于Ⅰ级和Ⅱ级,肝肾亏虚型、痰瘀交阻型多见于Ⅲ级、Ⅳ级。在严重度指数方面,肝肾不足、筋脉瘀滞型多见于轻、中度患者,脾肾两虚、湿注骨节型多见于中度、严重,肝肾亏虚型、痰瘀交阻型多见非常严重、极其严重。
MMP-1.-3.MMP-1/TIMP-1.MMP-3/TIMP-1与X线等级相关,X线等级越高,各指标数值均呈上升趋势；MMP-1.TIMP-1与膝骨关节炎严重度指数相关,膝骨关节炎越严重,MMP-1.TIMP-1呈上升趋势：可作为膝骨关节炎早期诊断、病情严重度及疗效评估的生物学指标。肝肾亏虚、痰瘀交阻型MMP-1/TIMP-1.MMP-3/TIMP-1高于其它两型,可作为膝骨关节炎肝肾亏虚、痰瘀交阻型的参考指标,为中医辨证分型的客观化、规范化提供依据。
手术后时间的延长,关节软骨退变逐渐加重,Mankin评分呈升高趋势,关节液中MMP-1.-3.TIMP-1.MMP-1/TIMP-1.MMP-1/TIMP-1呈升高趋势；表明它们与软骨退变有一定相关性。关节冲洗液中的MMP-1、-3含量变化可以反映软骨中MMP-1、-3蛋白表达变化。关节冲洗液中MMP-8、-13检出率低,与临床研究结果一致。
