厌氧发酵产酸微生物种群生态及互营关系研究

产酸微生物是有机物厌氧发酵过程中一类重要的微生物，其产生的挥发性有机酸（VFAs）是主要的中间产物之一，也是有机化工行业重要生产原料。而且，产酸过程与有机物降解和沼气的产生都有密切联系，产酸微生物与水解微生物、产甲烷微生物，甚至产酸微生物之间均有复杂的互营关系。近年来，高通量测序技术的发展突飞猛进，正成为微生物生态研究者们经常使用的生物技术。与传统测序方法通过对DNA片断中碱基的特异性切割不同，高通量测序技术能一次并行，对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。在产酸反应器中，为研究产酸微生物种群生态，添加产甲烷抑制剂是一种常用的技术方法，它能够阻止产甲烷菌利用乙酸的同时，不影响产酸微生物的生长。 本论文利用稳定性同位素标记和高通量测序等环境微生物学技术，研究了产酸微生物在厌氧发酵过程中所起的作用、明确了各产酸菌的种群结构以及它们之间的互营关系、阐明了不同功能菌群在生产VFAs中各自的贡献、并通过菌群结构与数量的调节，增强互营产酸以达到乙酸高产的目的。在此基础上，找出该工艺的最优操作条件，并建立动力学模型，为污泥厌氧发酵过程的研究丰富了理论与应用基础。主要的研究结果如下： 1葡萄糖厌氧降解中产酸微生物种群生态 单糖降解是有机物厌氧发酵中重要步骤，然而，对于BES抑制产甲烷情况下，厌氧污泥对葡萄糖降解起关键性作用的微生物研究则较少。利用DNA-SIP、克隆文库及高通量测序技术，考察污泥厌氧产酸与产甲烷两种模式下，微生物群落的演替情况后发现：未抑制产甲烷的厌氧发酵中占优势的是梭状芽孢杆菌（Clostridia），其丰度占到总细菌分类的51.88%，而芽孢杆菌（Bacilli）则在抑制产甲烷的厌氧发酵中占绝对优势，丰度占50%；未抑制产甲烷培养中Peptococcaceae、Syntrophomonadaceae以及Syntrophobacterale这三个菌属的丰度明显大于抑制产甲烷培养，说明产氢产乙酸菌与产甲烷菌的互营关系在厌氧产甲烷体系中发挥着重要作用。 2产氢产乙酸菌与同型产乙酸菌的互营关系 在污泥厌氧产酸体系中，通过加入丁酸盐强化产氢产乙酸过程可以显著提高同型产乙酸反应的活性。同型产乙酸反应的吉布斯自由能降至-15KJ/mol左右，同型产乙酸菌数量明显大于其它反应器；同型产乙酸菌的存在可“拉动”产氢产乙酸过程，但这种互营关系是有限的。在H2分压为3.2KPa，4g/L的丁酸和6g/L的乙酸体系中，产氢产乙酸和同型产乙酸的协同作用停止；在反应吉布斯自由能达到临界值时，产氢产乙酸菌与同型产乙酸菌可利用协同作用产生乙酸。在人为强化产氢产乙酸反应的情况下，协同作用中产氢产乙酸菌与同型产乙酸菌产生乙酸的比例为7:3。 3富集同型产乙酸菌对产酸微生物生态的影响 在厌氧污泥中选择性培养同型产乙酸，通过检测培养过程中有机酸、顶空气体以及关键酶活来鉴定同型产乙酸菌的富集情况。对富集前后的污泥进行高通量测序后发现，富集前的污泥多样性极大，其中厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)分别占到32.3%和42.9%。而富集后的污泥则集中在梭状芽孢杆菌属(Clostridium)，占总细菌的41.3%。另外富集前污泥中含有少量古菌(47OTU)，富集后污泥则未检测到古菌存在。 4强化同型产乙酸工艺条件优化 设计单因素影响实验，研究种泥浓度、底物浓度和pH值等条件对富集同型产乙菌的污泥在厌氧发酵过程中有机酸分布及乙酸累积的影响，结果表明，碱性条件有利于产乙酸菌的生长，但影响产氢产乙酸菌，尤其是丁酸降解菌的反应。产氢产乙酸菌和同型产乙酸菌的互营作用在6天后广泛存在，而且不同pH条件下，丙酸降解菌和丁酸降解菌的反应情况不竟相同；底物浓度过大，产氢产乙酸与同型产乙酸的互营机制受到抑制。 5强化同型产乙酸工艺的动力学模型 在ADM1模型基础上，构建强化同型产乙酸工艺的动力学模型，通过简化后的动力学模型与实验数据的模拟验证表明，拟合结果较为理想，可作为强化同型产乙酸工艺的设计依据。