PI3K通路介导的神经炎症参与高血压交感亢进的作用研究

【研究背景和目的】原发性高血压病是以血压升高为主要特征的慢性疾病,根据《中国高血压基层管理指南(2014年修订版)》提供数据表明中国约有三分之一的成人患有高血压疾病。因此,揭示高血压病的发病机制对高血压的防治尤为重要。有研究证实炎症参与了神经源性高血压的发生发展。血压正常的大鼠通过腹腔注射低脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导全身性轻度炎症可以显著升高血压,但在RAG-1-/-导致T细胞和B细胞缺乏无法产生免疫炎症反应的小鼠中,可以显著改善由血管紧张素II(Angiotensin II,Ang II)或醋酸去氧皮质酮诱导的高血压和血管功能异常。有研究报道在高血压患者和动物外周循环系统中存在轻度炎症反应,以上证据提示炎症参与了原发性高血压病的发生发展。在中枢神经系统内也存在免疫炎症反应,称之为神经炎症(neuroinflammation),主要以小胶质细胞激活导致促炎细胞因子产生增加为特征。有研究报道正常血压大鼠心血管调节核团下丘脑室旁核(Paraventricular nucleus,PVN)微量注射促炎细胞因子白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)或肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)可以引起血压和大鼠肾交感神经活动(Renal sympathetic nerve activity,RSNA)增加。另外,激活脑小胶质细胞可以延长脑室内注射Ang II引起的升压效应。延髓头端腹外侧区(rostral ventrolateral medulla,RVLM)是交感神经调控的关键中枢,在维持基础血压保持交感神经紧张性中具有重要作用。腹腔注射LPS诱导的全身炎症可导致RVLM内神经炎症产生,从而参与了血压升高和交感神经活动亢进等病理改变。因此,探究神经炎症在高血压心血管功能中枢调节中的作用和意义尤为重要,并为寻找高血压防治的新策略提供新的思路。肾素血管紧张素系统(Renin-angiotensin system,RAS)过度激活在高血压的发病机制中发挥着重要作用。在离体培养细胞和在体模型中,Ang II可以激活静止的小胶质细胞导致促炎细胞因子的产生。最近的证据表明Ang II的1型受体(Angiotensin II type 1 receptor,AT1R)阻断剂-坎地沙坦阻断AT1R可以减弱LPS诱导的中枢炎症反应。因此,上述研究提示Ang II诱导的神经炎症参与了高血压交感输出增强机制。已有研究证实血管紧张素转化酶2(Angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)在拮抗过度激活的RAS中发挥着重要的补偿机制,ACE2将Ang II和血管紧张素I(angiotensini,angi)转化成血管紧张素-1-7[angiotensin-1-7,ang-(1-7)],而ang-(1-7)通过与mas受体相结合发挥与angii相拮抗的生物学效应。ace2/ang-(1-7)/masr轴主要通过增加一氧化氮的合成减少ros生成发挥其心血管保护效应(如舒张血管、抗肥厚性心肌病等)。在心血管神经调节区域特异性过表达ace2能降低高血压大鼠血压水平和交感神经活动,并改善慢性心衰大鼠的压力反射功能。有趣的是,有研究报道ang-(1-7)对离体培养的小胶质细胞发挥抗炎效应。证据表明心血管调节中枢rvlm内磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3kinase,pi3k)通路参与了血压和中枢交感输出的调节。在高血压大鼠rvlm中pi3k通路明显上调,其失活导致rvlm内活性氧簇(reactiveoxygenspecies,ros)产生减少,改善高血压心血管功能。而本课题组之前发现在rvlm干扰pi3k-p110δ亚基的表达导致中枢抗高血压效应,而且pi3k通路也被证实参与了损伤和感染引起的外周的一些炎症反应。因此,本研究的主要研究目标是明确rvlm内pi3k通路在高血压神经炎症中发挥的作用,并探索异常的ras对高血压神经炎症的影响是否与pi3k通路有关。根据上述背景,本研究主要为了明确:1)在高血压大鼠rvlm中干扰pi3k基因表达能否抑制神经炎症;2)在血压正常的wky大鼠提前干扰rvlm内pi3k通路能否减弱angii诱导的血压升高和rvlm神经炎症;3)pi3k通路是否参与过表达ace2减弱高血压大鼠rvlm神经炎症发挥抗高血压效应。【研究方法】实验中所用的动物为体重280-320g的雄性wky大鼠和自发性高血压大鼠(spontaneouslyhypertensiverat,shr)。wky大鼠通过第四脑室灌注lps或angii来诱导神经炎症。通过elisa和免疫荧光分别检测各组大鼠rvlm内促炎细胞因子水平和小胶质细胞激活情况,westernblot检测各组大鼠rvlm内pi3k-p110δ亚基的表达以及akt的磷酸化水平。通过rvlm内注射相关慢病毒来特异性干扰rvlm内pi3k-p110δ亚基表达和过表达ace2,最后在shr进行验证。【结果】一、干扰rvlm内pi3k信号通路减弱高血压rvlm内神经炎症。wky大鼠rvlm内注射携带有gfp基因慢病毒15天后通过荧光显微镜发现rvlm内局限地表达gfp绿色荧光。为了验证携带有pi3k-p110δ-shrna的慢病毒的干扰效率,感染病毒后,大鼠rvlm内pi3k-p110δ亚基的表达显著降低,并观察到shr相比于wky大鼠rvlm内pi3k-p110δ亚基的表达显著增加。另外,相比于wky大鼠,shr-rvlm内促炎细胞因子含量(il-1β:55.9±18.2vs.141.8±7.54pg/mg,p<0.05;il-6:309±18.2vs.598±26.0pg/mg,p<0.05;tnf-α:56.3±3.76vs.98.0±15.4pg/mg,p<0.05),麻醉状态下血压(125±2.50vs.183±8.05mmhg),心率(363±10.6vs.441±11.4bpm)和基础rsna(11.3±0.514vs.38.0±2.03%max)也显著增加。重要的是,shr提前干扰rvlm内pi3k-p110δ亚基可以显著减少rvlm内il-1β、il-6和tnf-α的含量水平,以及改善麻醉状态下和清醒状态下心血管功能。而在wky大鼠中,rvlm内干扰pi3k-p110δ亚基的表达对其血压和心率没有影响。二、干扰rvlm内pi3k信号通路减弱angii诱导的神经炎症和心血管功能异常。第四脑室灌注angii可以显著增加wky大鼠rvlm内pi3k-p110δ亚基的表达和akt的473位丝氨酸磷酸化水平。为进一步明确pi3k对angii诱导的神经炎症的影响,在wky大鼠第四脑室灌注angii之前在rvlm内注射携带有pi3k-p110δ-shrna基因的慢病毒。wky大鼠第四脑室灌注angii一周后,心血管功能显著增加(map:148±1.89vs.116±2.75mmhg;hr:430±10.6vs.367±14.6bpm;基础rsna:24.6±2.72vs.10.2±1.00%max),并且rvlm内促炎细胞因子水平也显著增加(il-1β:188±17.7vs.126±3.76pg/mg;il-6:686±35.5vs.544±5.39pg/mg;tnf-α:94.5±5.94vs.66.0±3.55pg/mg),相比于第四脑室灌注acsf的wky大鼠。有趣的是,第四脑室灌注angii诱导的促炎细胞因子和心血管功能的增加可以被rvlm内预先干扰pi3k-p110δ亚基表达所减弱。三、过表达ace2抑制pi3k信号通路减弱高血压大鼠rvlm内神经炎症。RVLM内注射携带有ACE2基因的慢病毒过表达ACE2的效率通过RVLM内ACE2蛋白表达水平和Ang-(1-7)/Ang II比值显著增加来确定。相比于第四脑室灌注aCSF的WKY大鼠,通过第四脑室灌注LPS2周的WKY大鼠可以显著增加血压、心率和基础RSNA。第四脑室灌注LPS显著增加RVLM内促炎细胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)水平;此外,也显著上调RVLM内PI3K-p110δ亚基的表达以及增加AKT473位丝氨酸的磷酸化水平,这些改变均能被RVLM内预先过表达ACE2基因所阻断。在SHR中,RVLM内过表达ACE2四周后可以显著降低血压、心率和基础RSNA。相比于WKY大鼠,SHR-RVLM促炎细胞因子水平显著增加(IL-1β:92.9±13.3 vs.136±9.62 pg/mg,P<0.05;IL-6:428±83.8 vs.582±51.5 pg/mg,P<0.05;TNF-α:40.6±4.0 vs.65.4±11.1 pg/mg,P<0.05),这些增加的促炎细胞因子可以被过表达ACE2所降低。而且过表达ACE2也可以显著减少PI3K-p110δ亚基的表达以及AKT磷酸化水平。然而,WKY大鼠RVLM过表达ACE2可以对血压和PI3K信号并无影响。【结论】RVLM内PI3K/AKT通路激活介导的神经炎症导致高血压心血管功能异常,RVLM内干扰PI3K通路能抑制Ang II诱导神经炎症和心血管功能异常,而RVLM特异性过表达ACE2通过抑制PI3K/AKT通路活性减弱高血压RVLM神经炎症水平。本研究明确了PI3K通路介导的神经炎症参与高血压交感亢进,为高血压交感亢进的机制研究和防治策略提供了新思路。