中药逆转大肠埃希菌对β-内酰胺类抗生素耐药性的实验研究

目的研究三黄汤，黄连解毒汤和五味消毒饮三种中药方剂对产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌部分或全部恢复对抗生素敏感性的作用，考察三种复方中药产生最大逆转效果的最佳时间及浓度。并通过实验测定经三味复方中药培养的耐药性大肠埃希菌其超广谱β-内酰胺酶的活性及表达以进一步探讨三者对耐药性大肠埃希菌存在的逆转机制。 方法用纸片扩散法和双纸片协同法筛选产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌，用试管二倍稀释法确定三黄汤、黄连解毒汤和五味消毒饮三种复方中药的最低抑菌浓度，选取低于最低抑菌浓度的不同浓度在不同时间下培养耐药性大肠埃希菌，比较各中药不同浓度、不同时间的逆转效果，选取最佳逆转效果的培养时间和药物浓度，并将在此条件培养的耐药性大肠埃希菌提取超广谱β-内酰胺酶测定其逆转前后的活性和含量，探索其逆转机理。 结果从兰州市一所省级医院提取采集耐药性大肠埃希菌，用纸片扩散法和双纸片协同法筛选产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌作为实验标本。测定三种复方中药对标准株大肠埃希菌ATCC25922的最低抑菌浓度(MIC)，分别为MIC(三黄汤)为0.5g/ml；MIC(黄连解毒汤)为0.6g/ml；MIC(五味消毒饮)为0.7g/ml。测定产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌经克拉维酸培养，其药敏直径恢复到敏感程度的最低浓度为克拉维酸的最低逆转浓度。结果表明，克拉维酸使产ESBLs大肠埃希菌恢复其对抗生素敏感性的最低浓度为15μg/ml，将此浓度下培养的大肠埃希菌作为阳性对照。用三种中药方剂在低于最低抑菌浓度的不同浓度及时间条件下培养耐药性大肠埃希菌，记录各抑菌圈直径，用统计软件SPSS11.5析因分析方法处理数据，三黄汤在0.2g/ml 24h，黄连解毒汤在0.4g/ml 12h，五味消毒饮在0.3g/ml36h和0.4g/ml 48h的逆转效果最佳，但与阳性对照克拉维酸比较有显著性差异(P＜0.05)。同时提取超广谱β-内酰胺酶做三维实验，证明超声破碎法优于反复冻融法，以底物头孢噻肟与提取的超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)反应测定OD值，根据公式计算酶活，中药方剂能够抑制酶活性从而降低耐药性，与克拉维酸阳性对照逆转效果的比较未有显著性差异(P＞0.05)，与未经任何实验因素作用的产ESBLs大肠埃希菌阴性对照比较有显著性差异(P＜0.05)。中药方剂之间抑制酶活效果比较未见显著差异(P＞0.05)。比较三黄汤各拆方之间的抑酶效果，各拆方药液能够抑制酶活性，但与克拉维酸阳性对照比较有显著性差异(P＜0.05)，同时与未经逆转作用的产ESBLs大肠埃希菌阴性对照比较也有显著性差异(P＜0.05)。各拆方之间抑制酶活效果比较未见显著差异(P＞0.05)。将稀释后的蛋白标准溶液制作标准曲线，根据标准曲线公式计算样品中ESBLs含量。中药方剂能够抑制ESBLs的表达，但不及克拉维酸的抑制效果(P＜0.05)，而与未经任何实验因素作用的产ESBLs大肠埃希菌阴性对照比较有显著性差异(P＜0.05)。中药各拆方也能够抑制ESBLs的表达，效果与克拉维酸作用未见显著性差异(P＞0.05)，同时与未经任何实验因素作用的产ESBLs大肠埃希菌阴性对照比较有显著性差异(P＜0.05)。 结论本实验进一步证实，三黄汤、黄连解毒汤和五味消毒饮三种清热解毒方剂在逆转产ESBLs大肠埃希菌耐药性方面有确切作用，且逆转作用与中药浓度及培养时间有关。三者比较，三黄汤是逆转效果最大的中药方剂。通过对超广谱β-内酰胺酶活性及表达含量的测定发现，抑制超广谱β-内酰胺酶的活性和表达是中药逆转产ESBLS大肠埃希菌耐药性的主要途径之一，但并不排除其他逆转机制的存在，还需进一步探讨。