葛根素抑制酒精诱导的人骨髓间充质干细胞成脂分化

研究背景长期大量的酒精摄入可以导致酒精性骨病，包括酒精性骨质疏松、酒精性骨坏死等。随着世界酒精饮品消耗量的增加，酒精性骨病的发病率逐年增加，对人群健康造成极大危害。具体发病机制还不清楚。有研究表明，酒精可以通过上调体外培养小鼠、大鼠和人的骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells；MSCs）的过氧化物酶增殖物活化受体γ2（The peroxisomal proliferator-activated receptorγ2；PPAR-γ2）的基因表达，促进MSCs成脂分化，抑制其成骨分化，进而导致酒精性骨病的发生。而近年来研究发现，异黄酮类物质能够下调PPAR-γ2的基因表达，抑制地塞米松诱导的MSCs向脂肪细胞分化。 目的从细胞分子生物学角度研究葛根素是否对酒精导致人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells；hMSCs）成脂分化具有抑制作用，探讨葛根素对酒精性骨病的防治可能性。 方法 1 hMSCs分离与培养骨髓标本取自郑州大学第一附属医院骨科自愿受试的男性病人。所有受试者均无骨代谢性疾病。每位自愿者抽取骨髓8ml。采用Ficoll淋巴细胞分离液梯度离心法进行分离，获得原代hMSCs后，接种于含15％胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养。 2实验分组取传代细胞，随机分为3组：空白对照组、模型组（细胞培养基内每日加酒精0.09mol／L）、实验组(细胞培养基内每日加入酒精1次，0.09mol／L；每3日向细胞培养基内加入葛根素1次，10×10-6mol／L)。 3 ALP的检测分组后，分别采用酒精、葛根素进行实验干预。干预10d，采用全自动生化分析仪检测细胞内ALP活性。 4脂肪细胞染色实验干预21d，采用油红“O”法进行脂肪细胞染色，并在光镜下计数每cm2细胞爬片上脂肪细胞数量。 5基因表达的检测实验干预7d，采用RT-PCR两步法检测各组细胞内PPAR-γ2的基因表达情况。 结果 1 hMSCs的体外培养形态特点经梯度离心法分离获取hMSCs后，原代细胞接种于培养瓶内约4h开始贴壁，呈圆形的未伸展状态；4d左右细胞大部分贴壁，向外周伸展，呈饱满梭形，类似典型的成纤维细胞样。10d左右细胞数量显著增加，多数聚集形成小集落样生长，细胞沿一定方向排列。12～16d形成大小不等的集落。细胞多已覆盖瓶底达80％以上可进行细胞传代。 2细胞内ALP活性分组干预10d，测得细胞内ALP活性模型组中最低为（27.0±10.3U／100mg蛋白），显著低于对照组（39.6±8.7U／100mg蛋白）和实验组（40.2±10.1U／100mg蛋白）(P＜0.05)，实验组稍低于对照组，二者差异无显著性（P＞0.05）。 3脂肪细胞计数干预21d，模型组脂肪细胞数最多，达383±37／cm2，而且圆形细胞比例较实验组多，细胞内脂滴大而丰富。实验组脂肪细胞数约198±38个／cm2较模型组内脂肪细胞数显著减少（P＜0.05），对照组脂肪细胞出现极少仅约7±6个／cm2。 4基因表达干预7d，模型组细胞的PPAR-γ2基因表达水平显著高于对照组（P＜0.05）；而实验组细胞的PPAR-γ2基因表达水平显著低于模型组（P＜0.05），稍高于对照组，但二者间差异无显著性（P＞0.05）。 结论 1酒精具有导致hMSCs成脂分化的作用。 2葛根素能下调PPAR-γ2基因表达水平。抑制酒精导致的骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化，减少脂肪细胞的形成。 3葛根素能增加hMSCs细胞内ALP活性，保持其成骨分化能力。 因此，根据实验结果推测葛根素可能具有防治酒精性骨病的作用。