甘草黄酮的分离鉴定、药效及其指纹图谱研究

随着对甘草药理作用的进一步认识,全世界对甘草的需求日益增长,甘草资源急剧减少,合理开发甘草资源已十分必要。甘草的植物化学成分十分复杂,以往人们只对甘草中的三萜类化合物作了大量的研究,对其质量评价也仅以甘草酸的含量作为标准,难以全面地评价甘草的质量。近年来,对甘草药理作用的深入研究表明,甘草黄酮类化合物具有多种药理作用,是一类非常有效的活性成分。因此,本课题对甘草中总黄酮的分离纯化及重要单体甘草查尔酮A和光甘草定的分离鉴定和药效进行研究,同时建立胀果甘草黄酮类化合物的HPLC指纹图谱,为甘草黄酮资源的有效、合理开发和质量评价提供依据。 本论文首先建立了甘草中总黄酮的含量测定方法,测定胀果甘草、光果甘草和乌拉尔甘草中总黄酮平均含量分别为:4.476 %、2.478 %和1.372%。 对比研究了甘草总黄酮的几种不同提取方法,结果超声辅助法提取甘草总黄酮在提取时间和提取效率方面均优于其他几种方法。利用响应面分析法优化甘草总黄酮超声辅助提取的工艺参数,得到超声辅助提取甘草总黄酮的最佳工艺,以此工艺进行超声辅助提取甘草总黄酮一次提取率达到80.56 %。通过比较,选择AB-8大孔树脂纯化甘草总黄酮,优化了AB-8大孔树脂纯化甘草总黄酮的实验条件,经过纯化的甘草总黄酮含量达到60 %以上,收率80 %以上。 建立了基于生物信息学的甘草黄酮类化学成分抗乙酰胆碱酯酶活性虚拟评价的新方法,在光果甘草几种主要化合物成分中,光甘草定与乙酰胆碱酯酶的对接能和结合能均较小,结合“吻合度”很好,与三种乙酰胆碱酯酶抑制剂(加兰他敏、石杉碱甲和美曲膦脂)的对接能和结合能接近。通过分子对接分析,将光甘草定A环或B环上的氢原子用氟原子取代进行对接分析,得到对接能和结合能与光甘草定相似的小分子5’-氟光甘草定。 根据分子对接结果,从光果甘草中提取分离并鉴定了光甘草定,还建立了甘草中光甘草定的含量测定方法,测定了光果甘草中光甘草定的平均含量为0.199 %,而胀果甘草和乌拉尔甘草中没有检测到光甘草定。 以东莨宕碱所致的小鼠认知功能障碍为模型,研究了光甘草定对小鼠学习记忆功能的影响,在“Y”型电迷宫实验和跳台实验中,光甘草定组(2, 4 mg/kg)与模型组相比,学习记忆成绩均有显著提高,且光甘草定大剂量组(4 mg/kg)获得了与阳性组脑复康(400 mg/kg)相当的结果。中高剂量的光甘草定(2,4 mg/kg)和阳性药美曲膦脂(50 mg/kg)能使小鼠大脑乙酰胆碱酯酶的活性分别下降14.4%, 19.0%和21.3%。 本论文还从胀果甘草中提取分离了甘草查尔酮A,并运用LC-MS和NMR对其结构进行了鉴定。并建立了甘草中甘草查尔酮A的含量测定方法,测定了胀果甘草和光果甘草中甘草查尔酮A的平均含量分别为0.411 %和0.054 %,而乌拉尔甘草中没有检测到甘草查尔酮A。 以二甲苯所致的小鼠耳肿胀和角叉菜胶所致的大鼠足肿胀研究了甘草查尔酮A的抗炎效果,结果表明甘草查尔酮A (5,10 mg/kg)能显著抑制二甲苯所致的小鼠耳肿胀。三个剂量2.5,5和10 mg/kg的甘草查尔酮A均能显著抑制角叉菜胶所致的大鼠足肿胀。甘草查尔酮A (0.1, 0.5和1μg/mL )能显著抑制COX-2的合成和活性,且高剂量(1μg/mL)的甘草查尔酮A对COX-2合成的抑制作用要强于0.5μg/mL的阳性药吲哚美辛。 采用HPLC方法,以乙腈-0.1%冰醋酸为流动相进行梯度洗脱,对10批胀果甘草样品中黄酮类化合物进行了分析研究,并采用计算机软件对色谱峰数据进行评价,建立了胀果甘草黄酮类成分的HPLC指纹图谱,可利用其特征峰有效的评价甘草药材的质量。