G蛋白偶联受体GPR48在小鼠骨发育中的功能研究

1．GPR48在骨骼发育中的功能研究 脊椎动物骨骼系统发育需要两个完全不同的过程：胚胎发育过程和出生后发育过程。在胚胎发育过程中，大部分骨骼形成的主要途径是通过软骨内骨化，即间质细胞分化成软骨细胞并最终被成骨细胞取代。而出生后发育过程主要是骨质重建和维持，即成骨细胞不断地产生骨而破骨细胞吸收骨。所有这些过程都由复杂的信号调控网络所控制。 本文研究一个G蛋白偶联受体GPR48／LGR4，它是一个孤儿受体，属于糖蛋白荷尔蒙含有富含亮氨酸重复序列亚家族。目前还没有找到该受体的配体。G蛋白偶联受体含有7个跨膜结构域，它能将细胞外的信号传导通过其介导的3个异构体Gα，β，γ启动细胞内的级联信号从而使细胞外的信号转化成细胞的应答，但该基因是否与骨骼系统发育有关尚不得而知。我们利用小鼠基因敲除的方法来研究G蛋白偶联受体GPR48在骨质发育中的生物学功能。研究表明，基因敲除GPR48小鼠的胚胎骨形成比野生型小鼠迟缓，我们用Von kossa染色GPR48野生型和突变型小鼠胚胎E14.5期、E16.5期和E18.5期。可以观察到GPR48-／-突变小鼠骨矿化明显延迟。通过原位杂交和免疫组化实验，我们发现了三个标记基因：college typeⅡ；Indlan hedgehog，和转录因子sex9，比较野生型和突变小鼠无明显差异，这表明GPR48敲除小鼠的软骨细胞增殖和肥大分化早期的正常进程未受影响。但是，软骨细胞肥大标志基因oolα1（X）在GPR48-／-突变小鼠中分离明显比野生型晚，这说明敲除GPR48延迟了长骨软骨细胞的终末成熟。而出生后的骨形成也严重受到影响包括骨密度，骨体积，骨形成率和类骨质都下降，包括骨体积／组织体积、骨小梁厚度、骨小梁数目、矿物附着率、骨形成的动态指数反映出由于骨矿化沉积率和矿化表面的减少导致骨形成率减少了2成，，而骨小梁间隙则显著增加。而这些骨骼发育和功能上的表型缺陷和另外一个基因的敲除小鼠--ATF4敲除小鼠在骨骼发育中的表型非常相似。通过real-time PCR，Western Blot和原位杂交，我们发现在GPR48基因敲除小鼠中ATF4的表达确实显著下降。通过生物化学和信号途径分析，发现GPR48能通过cAiVlP-PKA-CREB信号途径来调节ATF4的启动子，从而调节ATF4基因的表达。而ATF4在成骨细胞的分化和发育过程中是一个转录因子，它调控的下游骨基质蛋白OCN，BSP和胶原蛋白的合成在GPR48敲除小鼠中也受到影响。证明GPR48能通过ATF4和它的下游基因这个信号途径来参与骨形成。 2．其它基因的研究工作 本人还参与了其它基因的研究工作，具体在如下几个方面： （1） Apolipoprotein中新短肽选择性抑制c-Src／FAK到ERK信号途径来抑制血管新生和肿瘤生长很多血管新生抑制剂来源于大的血浆蛋白。例如，人类阿朴脂蛋白的kringle5（KV）截短的片断是潜在的抗血管新生分子。然而，是否在KV结构域中存在一个更短的片断能够在血管新生中起作用并伴随肿瘤生长以及它们的作用机制还不清楚。我们选择一个人类aop（a）KV结构域的11个氨基酸的肽段（11肽）用于研究。这个肽段的血管新生的效应通过人类脐静脉内皮细胞（HUVEC）在体外进行测量，而在体内通过鸡胚的绒毛膜（CAM）分析和小鼠的角膜血管新生模型进行测量；我们进一步测量了11肽在移植瘤生长的效应并且它参与血管新生信号途径。在体外，血管新生在迁移（p＜0.01），入侵（p＜0.01），和管形成分析（p＜0.001）中都被11肽抑制。在体内，11肽在CAM分析（p＜0.001）和小鼠角膜血管模型（p＜0.001）中明显抑制血管新生。11肽并不影响肿瘤细胞的生长，但它抑制移植瘤的生长（p＜0.01），并且11肽处理组的存活率高于对照组（100％vs 20％，差异=80％）。另外，11肽选择性阻碍一些蛋白在Cdc42到细胞外信号调控激酶（ERK）信号这个过程中的表达。以上实验表明，11肽在体外和体内抑制血管新生，并且通过选择性阻碍Cdc42到ERK信号途径抑制肿瘤生长，它可能位于KV结构域的关键激活区。 （2） GCIP在骨骼肌分化和抑制癌症发生中的功能研究骨骼肌的分化是一个高度规则的多步骤过程，研究表明，GCIP在C2C12细胞向肌细胞的分化过程中其mRNA和蛋白表达水平都显著上升，在C2C12细胞系过表达GCIP能激活肌肉特异性基因的表达，并促进肌管的形成。而GCIP的突变体过表达抑制肌肉特异性基因的表达，从而抑制肌肉的发生。并且GCIP能直接与E12，E47和MyoD相互作用。这一结果说明GCIP作为一个新的功能蛋白能在肌肉发生过程中与MyoD／E47异源二聚体形成功能复合物来调节肌肉发生。 在很多人类癌症中都发现在15号染色体（15q和15q21）纯合体缺失和杂合体缺失现象，包括皮肤癌，乳腺癌，肺癌和膀胱癌。这提示在15号染色体的这个区域存在潜在的抑癌基因。GCIP定位在15号染色体区段（15q15）。我们发现GCIP的表达能强烈抑制很多人类癌症的发生，包括乳腺癌，前列腺癌，和结肠癌。在人类结肠癌中，GCIP的mRNA和蛋白表达降低，而用丁酸钠（sodium butyrate）处理结肠癌细胞SW80能导致GCIP的上调表达。这说明GCIP的功能是在细胞增殖中作为负调节因子。在结肠癌细胞SW80中过表达GCIP能导致有意义的抑制癌细胞克隆的形成，但用siRNA降低GCIP的表达却能启动癌细胞克隆的形成。而且，过表达GCIP能抑制细胞周期蛋白cyclinD1的启动子从而抑制cyclinD1的转录活性。我们的研究表明GCIP作为抑癌基因能抑制癌症的发生。 （3）本人还参与证明了GPR48能在眼前期发育中通过调控Pitx2来调控眼睛发育；同时在生殖系统中GPR48能通过调控雄性激素受体的表达来调控泌尿生殖系统发育；证明了E2通过ERα激活KiSS1基因的表达，而ERα则通过结合Sp1／Sp3蛋白并利用Sp1／Sp3识别结合KiSS1基因启动子上的GC富集区来刺激KiSS1基因转录。这有助于我们在分子水平理解类固醇激素对KiSS1的反馈调节作用。另外本人还参与人类ZNF394、ZNF4805NZNP411等基因的克隆、表达和功能研究，这些基因多数在心脏中表达，将是心脏发育相关候选基因。