杀蚜蝉拟青霉菌株筛选、培养及其致病作用研究

蝉拟青霉(Paecilomyces cicadidae（Miquel）Samson)是我国分布广泛,极具生防应用潜力的虫生真菌。本文以蚜虫为试虫,从不同来源的蝉拟青霉菌株中筛选出对中药材板蓝根蚜虫（Lipaphis erysimi）具有较高致病性的LB菌株,并系统研究其对蚜虫的入侵和致病过程、对蚜虫的致病性及其影响因子、生物学特性、液体及固体培养条件优化、粗毒素杀蚜活性及常用化学农药与该菌的相容性等内容。本研究旨在探索适合蝉拟青霉生物学特性的基本培养方法与技术,揭示其对蚜虫的致病机理及控制潜能,明确蝉拟青霉对蚜虫的相互作用关系,为蚜虫综合治理中有效利用蝉拟青霉提供理论依据,同时也为寄主与病原物互作关系的研究提供新的例证。结果如下: 1、菌株筛选。以不同昆虫寄主采集的拟青霉（Paecilomyces）和白僵菌（Beauveria）菌株对白术蚜虫（Macrosiphum sp.）进行生物测定。结果表明,不同属种的真菌菌株的致病性存在差异,其中蝉拟青霉的几个菌株表现了较强的致病力。进一步对12株蝉拟青霉菌株培养特性及其对蚜虫的致病性进行测定,结果表明不同菌株的培养特性和致病力存在差异,其中以蝉拟青霉LB菌株的致病力强、培养特性优良,对蚜虫的校正死亡率为80.97%,致死中时LT50为4.44d,致死中浓度LC50为0.87×10～6孢子/mL。 2、致病机理研究。通过扫描电镜观察,蝉拟青霉分生孢子在蚜虫体表萌发、形成芽管后可产生附着胞或直接侵入表皮,昆虫节间膜等薄弱处也是其侵染的主要部分,随后菌丝在昆虫体内形成,如湿度足够高,菌丝穿出体表产孢而再侵染新害虫。 用明胶-琼脂平板法研究了蝉拟青霉12不同来源菌株的胞外蛋白酶产酶水平与其毒力的关系。结果表明,不同菌株的产酶水平存在差异,且产酶水平的高低与其对蚜虫的毒力存在显著性关系。因此可以认为该菌的胞外蛋白酶活力是构成毒力的主要因素之一。 3、生物学特性及其与致病性的关系。温度、pH、湿度对蝉拟青霉生长、产孢及孢子萌发具有明显的影响。蝉拟青霉LB菌株生长、产孢及孢子萌发的最适温度是25℃。pH6时菌落生长最快,分生孢子产生及萌发的最适值为pH6～7。光照对菌落生长、孢子萌发没有明显影响,对产孢量有促进作用。孢子萌发的相对湿度范围为RH90%～100%,最适湿度是RH100%。 在20～30℃范围内,蝉拟青霉LB菌株对蚜虫有致病性,在25℃下毒力最强;不同温度和不同pH值下培养的蝉拟青霉产孢量有差别,但所获得的分生孢子在相同条件下对蚜虫的毒力没有差异。在RH90～100%范围内,蝉拟青霉LB菌株对蚜虫有致病性,在RH100%时毒力最强。温度、湿度对致病性有重要的影响,在温度、湿度的互作中,湿度更具有重要作用。 4、液体培养条件优化。通过对不同碳源、氮源、无机盐等对蝉拟青霉菌丝生长的影响研究,结果表明:葡糖糖为蝉拟青霉液体培养的最适碳源,蛋白胨为该菌生长的最适氮源,K2HPO4和MgSO4作为无机盐有利于菌丝生长。经正交试验筛选出的培养基为:葡萄糖3%,蛋白胨1.5%,磷酸氢二钾0.1%,硫酸镁0.2%组合为优良的液体培养基。摇瓶发酵的适宜条件为:培养温度25～27℃,初始pH6～7,接种量6%,摇床转速为150r/min,500 mL三角瓶最适装液量为100 mL,发酵周期为7d。 5、液体发酵代谢特性。随培养时间的延长,培养液中的还原糖含量、氨基氮含量、酸碱度和菌丝生物量均发生明显的变化。接种培养48h内,菌丝产量增长较慢;培养48～144h,菌丝生物量增长幅度最大,接种168h,菌丝生物量达22.45 g/L。培养液的pH值、糖含量、氮含量随培养时间的延长逐渐降低,菌丝快速生长的时期是糖、氮消耗最大的时期;192h后培养终止时,发酵液中的还原糖还有25%尚未消耗,而氨基氮的含量约为60%;接种72h后营养液的pH值降为4.56,因此接种72小时后,可适当增加pH值,以利蝉拟青霉菌丝生长。 6、固体培养条件优化。经单因素、一般组合和正交试验筛选,得到其适宜的固态发酵培养基为玉米粉+麦麸+黄豆粉+米糠（6∶4∶1∶1）。培养条件筛选结果表明,该菌株固态发酵培养的优化条件为:接种量6%、料水比1∶1.2、初始pH值6～7、培养温度24℃、发酵时间22d、培养基厚度在2cm左右、光照24h/d,添加ZnSO4或BaCl2有利于产孢。在此优化条件下固态发酵培养,其孢子产量稳定在45×10～8个/g以上,最高产孢量达到54.72×10～8个/g。 7、粗毒素杀蚜活性。发酵液对蚜虫的致死率达到81.11%,初步表明蝉拟青霉LB菌株液体培养能产生毒杀蚜虫的物质,而且杀虫活性较高。蚜虫对胞外粗毒素敏感,处理2d后的死亡率高,处理后蚜虫的死亡率随处理时间和浓度的提高而增加。胞内粗毒素提取物具有一定的杀蚜虫活性,但不及胞外粗毒素的效果明显。 8、化学农药与蝉拟青霉的相容性及增效性。不同的化学农药对蝉拟青霉菌丝生长、分生孢子萌发均有不同程度抑制作用。杀菌剂对菌丝生长、产孢、孢子萌发抑制作用大,杀虫剂相对较小。结果表明吡虫啉对菌丝生长抑制作用小,对孢子萌发无明显的影响,因此可以作为蝉拟青霉混用的首选药剂。该药剂与菌混用后具有明显的增效作用,菌孢子液与药（1:15000或1:30000）混用,致死中时LT50提前,蚜虫的校正死亡率提高。