黑布药膏对兔耳增生性瘢痕的作用机制研究

目的:增生性瘢痕是病理性瘢痕的一种,是皮肤真皮损伤愈合后瘢痕部位持续增生的一种病理现象,表现为高出正常皮肤、发红、坚硬,有时伴有瘙痒、疼痛等不适症状,不仅影响容貌和功能,还会给患者造成心理负担,而增生性瘢痕的防治是现代医学的难题之一,因此,寻找治疗和预防瘢痕增生的有效药物具有重要的意义。本课题选用著名皮肤病学专家赵炳南的经验方——黑布药膏,采用破瘀软坚之法来治疗兔耳增生性瘢痕,研究黑布药膏对兔耳增生性瘢痕动物模型成纤维细胞组织形态学、细胞增殖与凋亡及胶原合成与降解等方面的影响,从细胞、分子水平探讨黑布药膏治疗和预防增生性瘢痕的机制,为黑布药膏外用治疗增生性瘢痕提供理论和实验依据。 材料与方法:成年大耳白兔24只,随机分成3组,即正常对照组、瘢痕模型组和黑布药膏治疗组。正常对照组不施加任何处理因素,瘢痕模型组和黑布药膏治疗组进行增生性瘢痕造模,建立兔耳增生性瘢痕动物模型,21d后,造模成功,在黑布药膏治疗组瘢痕局部涂抹黑布药膏,每3d 1次,连续用药56d。在用药第2,4,6,8周分别切取两组瘢痕组织,进行指标检测。肉眼观察,在瘢痕形成和治疗过程中皮肤及瘢痕变化情况;HE染色,光镜下观察增生性瘢痕组织病理形态学改变,计算瘢痕增生指数和成纤维细胞密度;VG染色,光镜下观察增生性瘢痕组织胶原的变化,计算胶原面密度;采用免疫组化方法进行PCNA的检测,光镜下观察成纤维细胞的增殖情况,并计算PCNA阳性表达率;采用TUNNEL法进行细胞凋亡的原位检测,光镜下观察成纤维细胞的凋亡情况,并计算凋亡率;实时定量PCR(RT-PCR)法检测Bax、Bcl-2 mRNA的表达;RT-PCR法检测I、Ⅲ型胶原和基质金属蛋白酶-1 mRNA的表达;蛋白免疫印迹法(Western-blot)法检测转化生长因子-β1蛋白的表达。 结果: 1.肉眼观察,在兔耳腹侧面形成创面后,在造模后12～14d时,伤口基本愈合,并能触到硬结,造模后20～22d时,硬结更加明显,高于皮面,呈淡红色,增生范围不超过原创沿,厚度约为兔耳腹面皮肤厚度的2倍。模型组在上皮化后第六周瘢痕增生达到最高峰,厚度约为兔耳腹面皮肤厚度的3倍。黑布药膏治疗组随着给药时间的延长,瘢痕逐渐软化,体积逐渐缩小,趋于平复,色变淡。 2.光镜下观察,模型组可见真皮组织明显增生、变厚,由大量成纤维细胞、胶原组织及血管组成,胶原排列不整齐,呈结节或旋涡状分布,随时间推移,无明显变化。黑布药膏治疗组随时间推移瘢痕组织内血管、成纤维细胞逐渐减少,胶原纤维逐渐减少,呈淡红色,稀疏,排列较整齐。 3.黑布药膏对兔耳增生性瘢痕瘢痕增生指数的影响 黑布药膏治疗组较模型组瘢痕增生指数降低,从上皮化第4周开始,治疗组与模型组有显著性差异(P<0.01),并随着时间推移,瘢痕增生指数降低愈加明显。 4.黑布药膏对兔耳增生性瘢痕成纤维细胞密度的影响 模型组成纤维细胞密度明显高于正常组,与正常组比较有显著性差异(P<0.01),在上皮化后4周达到最高值,之后逐渐降低。黑布药膏可降低成纤维细胞密度,与模型组比较有显著性差异(P<0.05)。 5.黑布药膏对兔耳增生性瘢痕胶原面密度的影响 模型组胶原纤维的面密度明显高于正常组,与正常组比较有显著性差异(P<0.01),在上皮化后6周达到最高值,之后逐渐降低。黑布药膏可降低胶原纤维的面密度,从上皮化后第四周开始与模型组比较有显著性差异(P<0.01)。 6.黑布药膏对兔耳增生性瘢痕PCNA的影响 免疫组化法进行PCNA检测显示:正常皮肤表皮基底细胞层PCNA阳性表达,真皮层阳性表达较少。模型组除基底细胞PCNA阳性表达及部分棘细胞层和颗粒细胞层呈阳性表达外,真皮层见大量PCNA阳性表达细胞,与正常皮肤相比差异有显著性(P<0.01),治疗组PCNA阳性细胞较模型组明显减少,相比有显著性差异(P<0.05)。 7.黑布药膏对兔耳增生性瘢痕细胞凋亡的影响 TUNNEL法进行细胞凋亡原位检测,结果显示:在成纤维细胞和血管内皮中可见凋亡小体,即凋亡细胞。正常组皮肤中只有少量阳性细胞,瘢痕模型组上皮化2周到4周,凋亡率与正常皮肤相比无明显差异,上皮化后6周开始凋亡率降低,随时间推移凋亡率降低愈加明显,但和正常组相比没有统计学意义(P>0.05)。黑布药膏治疗组凋亡细胞较前模型组增多,真皮中见较多凋亡的成纤维细胞,而到了上皮化6周时达到凋亡高峰,至上皮化8周时凋亡率仍然持续很高。黑布药膏治疗组与模型组瘢痕凋亡率有显著性差异(P <0.01)。 8.黑布药膏对兔耳增生性瘢痕Bax mRNA表达的影响 实时定量PCR法检测Bax mRNA的表达,结果显示:与正常组比较,模型组Bax mRNA表达降低(P<0.05),并且随着上皮化时间越长,降低愈明显,从上皮化第六周开始,与正常组相比差异更加显著(P<0.01)。治疗组BaxmRNA表达较模型组明显增加,相比有显著性差异(P<0.01),并且随着上皮化时间越长,增加愈明显。 9.黑布药膏对兔耳增生性瘢痕Bcl-2mRNA表达的影响 实时定量PCR法检测Bcl-2mRNA的表达,结果显示:与正常组比较,模型组Bcl-2 mRNA表达增加(P<0.01),并且随着上皮化时间越长,增加愈明显。治疗组Bcl-2mRNA表达较模型组明显降低,从上皮化后4周开始相比有显著性差异(P<0.01),并且随着上皮化时间越长,降低愈明显。 10.黑布药膏对兔耳增生性瘢痕I型胶原mRNA表达的影响 实时定量PCR法检测I型胶原mRNA表达,结果显示:与正常组比较,模型组I型胶原mRNA表达显著升高(P<0.01),并且随着上皮化时间越长,升高愈明显。治疗组I型胶原表达较模型组降低,从上皮化后4周开始有显著性差异(P<0.01),并且随着上皮化时间越长,降低愈明显。 11.黑布药膏对兔耳增生性瘢痕Ⅲ型胶原mRAN表达的影响 实时定量PCR法检测Ⅲ型胶原mRAN表达,结果显示:模型组Ⅲ型胶原mRNA表达较正常组降低,并且随着上皮化时间越长,降低愈明显,从上皮化后6周开始,与正常组比较有显著性差异(P<0.01)。黑布药膏治疗组Ⅲ型胶原mRNA表达较模型组升高,并有显著性差异(P<0.01),并且随着上皮化时间越长,升高愈明显。 12.黑布药膏对兔耳增生性瘢痕基质金属蛋白酶-1mRNA表达的影响 实时定量PCR法检测基质金属蛋白酶-1mRNA的表达,结果显示:模型组MMP-1 mRNA表达较正常组降低,两组比较有显著性差异(P<0.01),并且随着上皮化时间越长,降低愈明显。治疗组基质金属蛋白酶-1mRNA表达较模型组明显增加,相比有显著性差异(P<0.01),并且随着上皮化时间越长,增加愈明显。 13.黑布药膏对兔耳增生性瘢痕转化生长因子-β1蛋白表达的影响 Western-blot法检测转化生长因子-β1mRNA的表达,结果显示:与正常组比较,模型组转化生长因子-β1表达显著升高(P<0.01),并且随着上皮化时间越长,升高愈明显。治疗组转化生长因子-β1表达较模型组降低,从上皮化后4周开始有显著性差异(P<0.05),从上皮化后6周开始,差异更加显著(P<0.01),并且随着上皮化时间越长,降低愈明显。 结论: 1.黑布药膏能够明显抑制成纤维细胞增殖及降低胶原纤维的含量,显著降低增生性瘢痕瘢痕增生指数、成纤维细胞密度及胶原面密度,从而抑制增生性瘢痕组织增生。 2.黑布药膏能够显著降低兔耳增生性瘢痕PCNA阳性表达率,增加细胞凋亡率,降低Bax mRNA表达,增加Bcl-2 mRNA表达,抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖,诱导细胞凋亡。 3.黑布药膏能够显著降低兔耳增生性瘢痕Ⅰ型胶原蛋白mRNA的表达,显著增加Ⅲ型胶原蛋白和基质金属蛋白酶-1mRNA的表达,降低转化生长因子-β1蛋白的表达,从而降低瘢痕组织胶原含量,增加胶原酶含量。