载脂蛋白M与肥胖代谢异常及其干预探讨

背景 大量研究显示,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平和冠心病的发病率呈负相关。提高HDL-C水平可延缓或预防动脉粥样硬化的发生。HDL-C抗动脉粥样硬化主要与HDL-C在胆固醇逆向转运(RCT)中发挥的关键作用有关。随着生活环境和膳食结构的改变,肥胖病发生率在全球范围内呈迅速上升趋势,肥胖是引起HDL-C降低的常见疾病。他汀类和贝特类药物是目前临床上常见的调脂药,研究表明他汀类和贝特类药物能不同程度的升高HDL-C水平和改善RCT。 载脂蛋白M(apoM)是新近发现的一种主要与HDL-C相关的载脂蛋白,对HDL-C的代谢起重要作用,它主要通过对前p-HDL生成的调节来影响人体RCT过程。apoM在HDL-C生成和RCT过程中不可替代。肝细胞核因子-1α(HNF-1α),叉头转录因子A2 (FoxA2)和肝X受体a(LXRa)是调节apoM表达的三个关键核受体。其中,前两者上调apoM的表达,后者下调apoM的表达。 目前尚不清楚他汀类和贝特类药物升高HDL-C和改善RCT是否与apoM有关；也不知肥胖状态下低HDL-C血症是否与apoM有关。研究证实肥胖是慢性炎症性疾病,且常伴随低脂联素血症,目前尚无肥胖状态下apoM与炎症因子和脂联素的关系研究。 目的 观察肥胖小鼠载脂蛋白M的改变,并探讨肥胖状态下载脂蛋白M与脂联素的关系,并揭示其机制;观察肥胖患者载脂蛋白M水平并探讨其与炎症因子的关系；探讨辛伐他汀和非诺贝特及两者联合对载脂蛋白M表达的影响及其机制。 方法 一、肥胖小鼠载脂蛋白M的改变及与脂联素关系的探讨 1.动物实验 32只3周龄雄性C57BL/6 N小鼠,随机分为4组(n=8／组)：(1)对照组：普通饮食,喂养12周；(2)肥胖组：高脂饲料,喂养12周；(3)肥胖干预组：高脂饲料,喂养12周后脂联素干预7天。(4)普通干预组：普通饮食,喂养12周后脂联素干预7天。分别于实验第0周、第12周及脂联素干预后测定体重,血浆脂联素,血糖,血浆胰岛素。实验结束时,取小鼠内脏脂肪并称取重量,取小鼠肝脏组织标本,采用实时定量逆转录聚合酶链反应(实时RT-PCR)和免疫印迹(Western Blot)检测小鼠肝脏载脂蛋白M、FoxA2的mRNA和蛋白的表达。 2.细胞实验 高浓度胰岛素诱导HepG2细胞构建胰岛素抵抗(IR)肝细胞模型,采用实时RT-PCR和Western Blot检测胰岛素抵抗状态下肝细胞的apoM基因和蛋白表达变化。脂联素分别干预胰岛素抵抗HepG2细胞、HepG2细胞24h,采用实时RT-PCR和Western Blot检测各组细胞载脂蛋白M、FoxA2的mRNA和蛋白的表达。 二、肥胖患者载脂蛋白M水平及其与炎症因子的关系研究 入选58例健康者和40例肥胖患者作为研究对象,常规测量血压、体重、身高,计算体重指数,抽取空腹静脉血检测其血糖、血脂、空腹胰岛素、血浆apoM、白细胞介素-6(IL-6)、高敏C反应蛋白(hs-CRP)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、血浆脂联素,并检测肱动脉内皮舒张功能(FMD)。 三、辛伐他汀和非诺贝特对载脂蛋白M表达的影响及调控机制 1.动物实验 32只8周龄健康雄性C57BL/6N小鼠,随机分为四组(n=8／组)：(1)对照组：正常普通饮食喂养;(2)他汀组：辛伐他汀(10mg/kg/天)干预4周；(3)贝特组：非诺贝特(100mg/kg/天)干预4周；(4)联合组：辛伐他汀(10mg/kg/天)和非诺贝特(100mg/kg/天)干预4周；分别在实验前(0周)、实验4周测定空腹血脂水平。4周后取动物肝脏组织标本,采用实时RT-PCR和免疫印迹(Western Blot)测定肝脏apoM的基因和蛋白表达,同时采用实时RT-PCR和Western Blot测定肝脏HNF-1α和LXRa的基因和蛋白表达。 2.细胞实验 分别以不同浓度的辛伐他汀(0、1、5、10、25μmol/L)和非诺贝特(0、50、100mmol/L)及辛伐他汀(5.0μmol/L)+非诺贝特(50mmol/L)、辛伐他汀(25μmol /L)+HNF-1α抑制剂、辛伐他汀(25μmol/L)+LXRα激动剂、非诺贝特(100mmol /L)+HNF-1α抑制剂、非诺贝特(100mmol/L)+LXRa抑制剂干预HepG2细胞24h。提取各组细胞总RNA和蛋白质,分别采用实时RT-PCR和Western Blot检测apoM的mRNA和蛋白的表达。采用实时RT-PCR和Western Blot检测HNF-1α和LXRα的基因和蛋白表达。 结果 一、肥胖小鼠载脂蛋白M的改变及与脂联素关系的探讨 1.与对照组比较,肥胖组、肥胖干预组小鼠体重显著高于对照组(P<0.05),肥胖组的内脏脂肪重量、空腹血糖、空腹胰岛素、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)显著高于对照组(P均<0.05)；与对照组比较,肥胖组血浆脂联素水平显著下降(P<0.05);肥胖干预组血糖、血浆胰岛素、胰岛素抵抗指数显著低于肥胖组(P均<0.05),肥胖干预组血浆脂联素水平显著高于肥胖组(P<0.05),肥胖干预组内脏脂肪重量与肥胖组比较无统计学差异。 2.与对照组比较,肥胖组肝脏载脂蛋白M的mRNA和蛋白表达显著下降(P<0.05)。 3.与对照组比较,肥胖组肝脏FoxA2的mRNA和蛋白表达显著下降(P<0.05)。 4.脂联素干预后的肥胖干预组小鼠载脂蛋白M的mRNA和蛋白表达显著高于肥胖组(P<0.05),脂联素作用于普通干预组小鼠载脂蛋白M的mRNA和蛋白表达与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。 5.脂联素干预后的肥胖干预组小鼠FoxA2的mRNA和蛋白表达,血浆脂联素水平显著高于肥胖组(P<0.05)；空腹血糖、空腹胰岛素、HOMA-IR均显著低于肥胖组(P<0.05)。脂联素作用于普通干预组小鼠FoxA2的mRNA和蛋白表达与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。 6.胰岛素抵抗HepG2细胞较HepG2细胞载脂蛋白M、FoxA2的mRNA和蛋白表达均显著下降(P均<0.05)。 7.脂联素干预后,胰岛素抵抗HepG2细胞载脂蛋白M、FoxA2的mRNA和蛋白表达显著增加(P均<0.05)。 8.脂联素干预后HepG2细胞载脂蛋白M、FoxA2的mRNA和蛋白表达无显著变化(P均>0.05)。 二、肥胖患者载脂蛋白M水平及其与炎症因子的关系研究 1.与对照组比较,肥胖患者的血浆apoM、HDL-C、血浆脂联素、FMD水平显著降低(P<0.05),空腹胰岛素、IL-6、TNF-α、hs-CRP水平升高(P<0.05)。 2.肥胖患者血浆apoM与HDL-C显著正相关(P<0.05),血浆apoM与BMI、胰岛素、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、IL-6、TNF-α、CRP水平显著负相关(P均<0.05),血浆apoM与血浆脂联素、LDL-C、TC、TG、血压、血糖、FMD无显著相关(P均>0.05)。对照组apoM与HDL-C显著正相关(P<0.05),血浆apoM与BMI显著负相关(P<0.05),血浆apoM与胰岛素、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、IL-6、TNF-α、CRP血浆脂联素、LDL-C、TC、TG、血压、血糖、FMD均无显著相关(P均>0.05)。 三、辛伐他汀和非诺贝特对载脂蛋白M表达的影响及调控机制 1.与对照组比较,药物治疗组HDL-C均显著升高,联合组升高程度高于他汀组和贝特组(P<0.05)；药物治疗组apoM的基因和蛋白均显著升高,联合组升高程度高于他汀组和贝特组(P<0.05)：细胞实验显示,辛伐他汀和非诺贝特均呈剂量依赖性上调apoM的表达,联合组升高程度高于他汀组和贝特组(P<0.05)。辛伐他汀+HNF-1α抑制剂组、辛伐他汀+LXRα激动剂组apoM的基因和蛋白水平均显著低于同浓度辛伐他汀组(P<0.05)；非诺贝特+HNF-1α抑制剂组apoM的基因和蛋白水平均显著低于同浓度非诺贝特组(P<0.05),非诺贝特+LXRα抑制剂组apoM的基因和蛋白水平均显著高于同浓度非诺贝特组(P<0.05)。 2.与对照组比较,药物治疗组HNF-1α的基因和蛋白均显著升高,联合组升高程度高于他汀组和贝特组(P<0.05)；细胞实验显示,辛伐他汀和非诺贝特均呈剂量依赖性上调HNF-1α的基因和蛋白表达,联合组升高程度高于他汀组和贝特组(P<0.05)。 3.他汀组LXRα的基因和蛋白表达显著降低(P<0.05),贝特组LXRα的基因和蛋白表达显著升高(P<0.05),联合组LXRα的基因和蛋白表达与对照组比较无显著差异(P<0.05)；细胞实验显示,辛伐他汀呈剂量依赖性下调LXRα的基因和蛋白表达(P<0.05),非诺贝特呈剂量依赖性上调LXRα的基因和蛋白表达(P<0.05),联合组LXRα的基因和蛋白表达与对照组无显著差异(P<0.05)。 结论 1.肥胖小鼠载脂蛋白M、FOXA2基因和蛋白表达明显下降,载脂蛋白M下降可能与FOXA2表达降低有关。 2.肥胖小鼠血浆脂联素水平显著下降,内脏脂肪重量、空腹血糖、空腹胰岛素、HOMA-IR显著增加。 3.脂联素可上调肥胖小鼠载脂蛋白M表达,其机制可能与脂联素改善胰岛素抵抗,进而上调FOXA2表达有关。 4.脂联素可上调胰岛素抵抗HepG2细胞载脂蛋白M表达,却对HepG2细胞载脂蛋白M表达无影响,这提示脂联素对载脂蛋白M的调控可能是间接通过影响胰岛素抵抗来实现的。 5.肥胖患者血浆apoM显著降低,apoM水平降低可能是肥胖患者HDL-C下降的潜在机制之一。 6.肥胖患者apoM水平与hs-CRP、TNF-α、IL-6水平密切相关,apoM可能受到这些炎症因子的调控,其机制可能与炎症因子促进胰岛素抵抗有关。 7.肥胖患者apoM水平与FMD无显著相关,提示apoM还不能作为早期动脉粥样硬化预测因子。 8.辛伐他汀和非诺贝特升高HDL-C可能与上调apoM表达有关,两者联合疗效更显著。 9.辛伐他汀和非诺贝特上调apoM表达的机制与两者调控HNF-1α和LXRa有关,两药具有互补性：前者上调HNF-1α抑制LXRa,后者上调HNF-1α和LXRa,这可解释联合用药比单药更能显著升高HDL-C和apoM。