从HPA轴水平初步探讨缺血性中风急性期补肾护脑法的生物学基础

中风病急性期的治疗一直是医学界关注的重点,它直接关系到中风病的预后转归和功能恢复。“扶正”与“祛邪”在中风病的治疗中相辅相成,贯穿始终,急性期治疗多采用偏重祛邪的方法,但在临床实践中我们发现,早期应用“扶正”的方法对促进功能恢复、改善预后转归具有重要的意义。本研究在病证结合模式指导下,从理论、实验、临床多方面入手,从脑肾相关的角度探讨了缺血性中风急性期应用补肾法对促进功能恢复、改善预后转归的积极作用,以期完善中医脑病理论,并为中风病疗效评价体系提供生物学的效应指标。 理论研究部分：利用脑病文献库对650余本古代医籍的电子图书进行整理,将其中与脑肾理论相关的论述内容梳理分类,从组织结构络属、生理功能联系、病因病机影响、理法方药应用多层次论述了脑肾关系。肾藏精,精生髓,髓通于脑,脑为髓会聚之处,二者密切相关,组织结构、生理功能等方面的内在联系,构成了它们在病因病机上相互影响的重要基础,也是临床中运用补肾法治疗中风病的理论依据。 动物实验部分： 目的：通过观察MCAO模型大鼠缺血后不同时点ACTH、CRH和COR的动态变化,地黄饮子加减方对ACTH、CRH和COR表达的干预作用及其对神经细胞凋亡、HSP70表达水平的影响,探讨其在脑缺血后纠正HPA轴功能紊乱、促进神经保护的作用效应,以揭示缺血性中风病早期应用补肾中药对脑组织的保护机制,也为临床应用补肾护脑法减轻神经功能缺损和神经元损伤、改善预后转归提供了理论依据。 方法：健康雄性SD大鼠,体重280g±10g。第一部分实验中随机分为正常组、假手术组、模型组,每组分为两个时点,每个时点8只,手术组采用改良的线栓法建立MCAO模型,分别于造模后6h、48h取材,检测血ACTH、CRH、COR含量,以多聚甲醛灌注固定取脑,于视交叉处将大脑前后分开,将脑组织石蜡包埋切片,切片厚度约为4μm,做HE染色观察神经细胞形态的变化,用免疫组织化学染色方法观察不同时间点脑组织细胞凋亡的表达。第二部分实验中随机分为模型组、中药组、假手术组,每组10只,造模后第2天开始灌胃,地黄饮子组每日灌胃中药1ml·kg-1,模型组和假手术组灌胃等体积的蒸馏水,连续7天,于最后一次灌胃结束后1h取材,检测血ACTH、CRH、COR含量,以多聚甲醛灌注固定取脑,将脑组织石蜡切片做HE染色观察神经细胞形态的变化,并用免疫组织化学染色方法观察细胞凋亡和HSP70的表达。 结果： 1.血浆ACTH、CRH、COR含量的测定结果 在脑缺血发生后6h,模型组和假手术组的CRH、ACTH、COR含量明显均低于正常组,统计学结果有显著差异；在48h时模型组ACTH、COR的含量明显高于正常组和6h模型组,统计学结果有显著差异；CRH的含量较6h时进一步降低,明显低于正常组,统计学结果有显著差异。 2.MCAO大鼠不同缺血时点脑组织细胞凋亡表达 模型组大鼠造模后6h即可见TUNEL染色阳性细胞,48h仍可见,与正常组和假手术组比较,有极显著差异(P<0.01),但6h与48h组之间统计学无明显差异。 3.地黄饮子加减方对MCAO大鼠血浆HPA轴的干预作用 脑缺血发生后7天,模型组的ACTH、CRH含量均明显低于正常组,COR含量明显高于正常组,统计学有显著差异；地黄饮子组的COR明显低于正常组、模型组,统计学有显著差异；地黄饮子组ACTH、CRH含量均明显高于模型组,统计学有显著差异；ACTH、CRH含量略低于正常组,统计学无差异。COR与ACTH和CRH呈反向性变化。 4.地黄饮子对MCAO大鼠缺血后脑组织细胞凋亡表达的干预效应 灌胃7天后的MCAO大鼠,模型组、中药组均可见脑组织有细胞凋亡表达,二者与正常组相比,统计学结果有显著差异(P<0.01)；模型组脑组织细胞凋亡表达较中药组明显,模型组与中药组相比,统计学结果有显著差异(P<0.01)。 5.MCAO大鼠缺血后HPA轴与脑组织细胞凋亡表达的相关性分析 模型组ACTH含量与脑组织细胞凋亡表达的TUNEL染色结果存在显著负相关关系,但CRH、COR则与凋亡表达无明显相关性。中药组ACTH、CRH、COR三者与脑组织细胞凋亡表达无明显相关性。 6.地黄饮子对MCAO模型大鼠脑组织HSP70表达的干预效应 同正常组比较,模型组和中药组脑组织均有HSP70表达,且统计学有显著差异；同模型组相比,中药组脑组织的HSP70表达更为明显,统计学有显著差异。 7.MCAO大鼠缺血后HPA轴与脑组织HSP70表达的相关性分析 模型组COR含量与脑组织HSP70表达存在显著正相关关系,但CRH、ACTH则与HSP70表达无明显相关性。中药组HPA轴各指标与脑组织HSP70表达无明显相关性。 结论： 1.脑缺血后6h,HPA轴呈抑制状态；脑缺血后48h,HPA轴明显紊乱,可能是该时点症状加重、死亡率增高的一个原因。 2.地黄饮子加减方可以改善MCAO模型大鼠术后的整体状态,减轻动物体重下降率。 3.地黄饮子加减方可以通过提高CRH的含量来抑制大鼠体内COR的释放,从而改善HPA轴的紊乱状态。 4.地黄饮子加减方可以明显抑制脑组织细胞凋亡的表达,这种作用可能与其改善HPA轴的紊乱状态有关。 5.地黄饮子加减方可以通过促进缺血区脑组织HSP70的表达发挥神经保护作用。 临床研究部分：以病证结合模式为指导,探讨缺血性中风急性期证候与生物学指标的相关性,本研究病例的数据来源于国家重点基础研究发展计划(973计划)课题-缺血性中风病证结合的诊断标准与疗效评价体系研究(课题编号：2003CB517102)。使用《缺血性中风证候要素诊断量表》,纳入211例急性期缺血性中风病患者,动态采集四诊信息以判断证候要素,采集血清标本进行生物学指标ACTH、COR、HSP70的检测,初步探讨了它与中医证候、病机在生物学基础层面的关系,从一定程度上完善了缺血性中风病证结合的诊断标准,为建立早期运用补肾中药对缺血性中风患者预后影响的临床疗效评价体系提供了生物学指标依据,同时也为构建完整的中医脑病理论体系奠定了基础。