黄芪甲苷调控PTEN/PI3K/Akt信号通路介导心肌梗死后血管新生与心肌保护的实验研究

目的:通过构建急性心肌梗死大鼠模型及体外培养人脐静脉性内皮细胞(HUVEC细胞),观察黄芪甲苷(AS-IV)促进心肌梗死后血管新生及相关心脏保护作用,并探讨促血管新生作用与PTEN/PI3K/Akt信号通路之间的关系,明确作用机制。方法:1.体内实验应用左心室前降支(LAD)结扎术构建大鼠心肌梗死动物模型,随机分为:假手术组(Sham,n=15)、心肌梗死模型组(Model,n=15)、AS-Ⅳ 低剂量组(AS-20mg/kg,n=15)、AS-Ⅳ高剂量组(AS-Ⅳ 50mg/kg,n=15);假手术组与心肌梗死模型组灌胃等量生理盐水。给药及观察时间为2周。干预2周后心超检测心脏功能;TTC法染色观察心肌梗死面积;H-E染色以及Masson染色观察梗死组织病理变化以及纤维化程度;α-SMA免疫组化评估心肌梗死边缘组织血管新生情况;TUNEL法观察梗死灶边缘细胞凋亡的情况;电镜评估心肌组织线粒体、肌丝、内质网等超微结构病变情况;Western Blot方法检测 PTEN、PI3K、t-Akt、p-AKT、VEGF、Bcl-2、Bax 等蛋白表达。2.体外实验(1)通过设置对照组,采用CCK-8法检测不同浓度AS-Ⅳ对HUVEC细胞增殖能力的影响;同时开展Matrigel基质胶管腔形成实验观察不同浓度AS-Ⅳ对HUVEC管腔形成能力的作用;Western Blot法检测血管新生相关因子及PTEN/PI3K/Akt通路在不同浓度AS-Ⅳ干预下的表达情况;在此基础上,筛选出AS-Ⅳ干预HUVEC促血管新生的最佳浓度;(2)由上海吉凯基因协助构建编码过表达PTEN慢病毒载体,课题组进行感染HUVEC细胞及相关感染效率检测;(3)通过慢病毒转染方法过表达HUVEC细胞PTEN基因后,采用经筛选后的最佳药物浓度(80μmol/L)干预HUVEC,共分为Control组(无血清培养基培养)、AS-Ⅳ组(AS-Ⅳ80μmol/L+无血清培养基)、AS-Ⅳ+Lv-GFP组(AS-Ⅳ 80μmol/L+仅表达GFP的空载慢病毒载体+无血清培养基)及AS-Ⅳ+Lv-PTEN组(AS-Ⅳ80μmol/L+过表PTEN慢病毒载体+无血清培养基)。随后利用CCK-8法检测不同条件下HUVEC细胞增殖能力的差异;同时开展Matrigel基质胶管腔形成实验观察不同条件下AS-Ⅳ对HUVEC管腔形成能力的不同;Western Blot法检测在过表达PTEN基因后通路下游因子在AS-Ⅳ干预下的表达情况。明确AS-Ⅳ促体内外血管新生与PTEN/PI3K/Akt信号通路之间的内在联系。结果:1.选取60只心肌梗死手术后成功复苏的大鼠纳入研究,总体造模成功率约为60%;2.与模型组相比,AS-Ⅳ治疗组能够提高心梗大鼠的心脏收缩及舒张功能,LVEF及LVFS明显改善(P<0.01),心腔扩张程度有所改善,并且存在剂量依赖关系;3.与模型组相比,AS-Ⅳ治疗组能够显著减少心肌梗死面积(P<0.01),AS-Ⅳ高剂量组与低剂量组相比,梗死面积得到进一步缩小(P<0.01);4.AS-Ⅳ治疗组心肌细胞病变程度、纤维组织增生与胶原组织沉淀较心肌梗死模型组少,少量炎细胞浸润;AS-Ⅳ高剂量组与低剂量组相比,病变程度与纤维化水平得到进一步改善;5.与模型组相比,AS-Ⅳ治疗组细胞抗凋亡因子Bcl-2明显上调、促凋亡因子Bax明显下调(P<0.01);AS-Ⅳ高剂量组与低剂量组相比,抗凋亡能力得到进一步提高(P<0.01);TUNEL免疫荧光也提示AS-Ⅳ治疗组心肌细胞凋亡程度较模型组为轻;6.与模型组相比,AS-Ⅳ治疗组心肌细胞线粒体及肌丝损伤明显改善,线粒体肿胀、融合数明显减少,肌丝排列有序,其中高剂量治疗组较低剂量治疗组改善更为显著;7.与模型组相比,α-SMA免疫组化法观察AS-Ⅳ治疗组新生血管明显增多(P<0.01);AS-Ⅳ高剂量组与低剂量组相比,血管新生数量得到进一步提高(P<0.01);8.AS-Ⅳ治疗组PTEN水平明显下调、下游因子PI3K/Akt的表达水平与磷酸化程度随之明显增加(P<0.01);9.AS-Ⅳ与HUVEC共培养,可以促进HUVEC细胞增殖能力,在此基础上,AS-Ⅳ还具有促进HUVEC管腔形成的能力,并且在AS-Ⅳ干预后PTEN/PI3K/Akt信号通路及VEGF的表达也明显增强(P<0.01);经过筛选,80μmol/L浓度AS-Ⅳ是干预HUVEC促进其增殖与管腔形成的最适浓度;10.慢病毒为载体对HUVEC细胞进行目的基因(PTEN)过表达是合适的实验方法,其最佳条件为:MOI=10,含 5μg/mlPolybrene,同时加入 Enhanced Infection Solution 与病毒共培养72h;11.与AS-Ⅳ组相比,过表达PTEN后,AS-Ⅳ促进PI3K水平上调及Akt磷酸化趋势明显减弱(P<0.01),从而减弱了细胞增殖及管腔形成的能力。这提示AS-Ⅳ是通过下调PTEN水平,进而上调PI3K/Akt通路因子的表达及磷酸化程度,从而介导血管新生并产生心脏保护作用。结论:黄芪甲苷可以促进心肌梗死后血管新生并产生心脏保护作用,其作用机制为通过抑制PTEN表达,进而上调PI3K/Akt通路因子及VEGF的表达。