番石榴叶提取物辅助降血糖作用及其机制研究

近年来，全球糖尿病患病率呈逐年上升趋势。2002年我国成人糖尿病患病率为2.6％，估计全国糖尿病现患人数2000多万，到2025年将达到3800万。糖尿病是一组因胰岛素绝对或相对缺乏引起的以高血糖为特征的代谢性疾病。慢性高血糖产生葡萄糖毒性作用，与糖尿病及其并发症的发生发展密切相关。因此，严格控制血糖，是糖尿病治疗的基本要求，寻找方便易行、安全可靠的控制血糖方法，对糖尿病的预防和治疗显得十分重要。 番石榴叶具有辅助降血糖作用，其作用机制和功效成分研究尚不广泛深入。我国番石榴自然资源丰富，海南、广东、广西、台湾、福建、云南、贵州和四川等省、自治区有引种种植或遗为野生的种类。四川攀枝花地区野生番石榴叶辅助降血糖作用未见研究报道。 本文研究攀枝花地区野生番石榴叶提取物辅助降血糖作用及其机制，为开发利用番石榴叶野生资源提供参考依据。 全文从以下三部分进行研究： 1番石榴叶提取物制备和及其辅助降血糖作用比较 目的制备番石榴叶水提取物和不同浓度乙醇提取物，比较不同提取物对糖尿病小鼠辅助降血糖作用，筛选安全、有效的降血糖提取物。方法采摘攀枝花地区野生番石榴叶，清洗、晾干、打碎，分别用蒸馏水、65％和95％食用乙醇浸提，浸提液过滤、浓缩、干燥(乙醇提取物用乙醚脱脂)后，研磨成粉得水提取物(WE)、65％乙醇提取物(AE65)和95％乙醇提取物(AE95)。选用雄性昆明种小鼠，链脲佐菌素(STZ)80mg／kg腹腔注射诱导糖尿病。WE、AE65和AE95悬液灌胃4周，降血糖药物格列吡嗪(Glipizide)作为降血糖效果阳性对照，比较三种提取物辅助降血糖效果，比较各组小鼠生长情况。结果WE、AE65和AE95等三种提取物得率分别为14.5％、22.0％和11.0％。三种提取物均可明显降低糖尿病小鼠禁食3h空腹血糖，在1.25g／kg剂量水平，AE95组小鼠血糖降低31.3％，降血糖程度明显低于Glipizide组(43.2％)；WE和AE65组小鼠血糖分别降低36.3％和33.5％，降血糖程度低于Glipizide，但三者差别没有统计学意义；三种提取物中，WE对小鼠的体重影响较小。WE的1.25、2.5和5.0g／kg三个剂量中，低剂量和中剂量组小鼠血糖下降差别没有统计学意义，对糖尿病小鼠体重增长的影响与模型对照组和Glipizide阳性对照组相似；高剂量WE组小鼠血糖降低45.4％，和Glipizide相近，但对小鼠体重增长影响较大。结论番石榴叶水提取物、65％乙醇提取物和95％乙醇提取物均具有辅助降血糖作用；水提取物安全性较高。 2番石榴叶水提取物辅助降血糖作用机制研究 2．1番石榴叶水提取物对小肠粘膜α-葡萄糖苷酶活性的影响 目的研究番石榴叶水提取物(WE)对小肠粘膜α-葡萄糖苷酶的抑制作用。方法选用雄性昆明种小鼠，STZ腹腔注射(80mg／kg)诱导糖尿病模型。以小鼠小肠粘膜生理盐水匀浆液用作α-葡萄糖苷酶待测液，与双糖底物孵育，比色法测定葡萄糖产量代表α-葡萄糖苷酶的活性。比较正常对照组小鼠和糖尿病小鼠小肠粘膜α-葡萄糖苷酶活性，测定WE对糖尿病小鼠小肠粘膜α-葡萄糖苷酶活性的影响，Lineweaver-Burk作图判断WE对α-葡萄糖苷酶抑制作用类型。结果WE对糖尿病小鼠小肠粘膜蔗糖酶和麦芽糖酶具有较强的抑制作用，并呈剂量效应关系，抑制作用类型为部分竞争性和非竞争性混合型。结论番石榴叶水提取物具有抑制糖尿病小鼠小肠α-葡萄糖苷酶作用，减缓肠道碳水化合物消化吸收可能是其辅助降血糖作用机制之一。 2．2番石榴叶水提取物对肝脏糖代谢的调节作用 目的研究番石榴叶水提取物(WE)对糖尿病小鼠肝脏糖代谢的影响，探讨辅助降血糖作用分子生物学机制。方法雄性昆明种小鼠，链脲佐菌素(STZ)80mg／kg腹腔注射诱导糖尿病模型。实验小鼠分为正常对照组、糖尿病模型对照组和WE辅助降血糖组，WE按2.5g／kg剂量灌胃4W，葡萄糖溶液灌胃进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)，丙氨酸溶液腹腔注射进行12h空腹糖异生实验；小鼠脱颈椎处死，测定肝糖原含量，实时荧光定量PCR(Real-time PCR)测定肝组织中葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6pc)和肝糖原合酶(Gys-2)等糖代谢关键酶mRNA水平。结果与正常对照组小鼠相比，糖尿病模型对照组小鼠3h和12h空腹血糖(21.29和12.76mmol／L)明显升高，口服葡萄糖耐量明显减低(AUC=48.11)，丙氨酸注射1h和2h糖异生率明显升高(36.5％和59.1％)，肝糖原含量(3.01mg／g)明显减少。WE灌胃4周后，与糖尿病模型对照组小鼠相比，WE灌胃组小鼠3h和12h空腹血糖(14.09和8.04mmol／L)明显降低，口服葡萄糖耐量明显改善(AUC=36.81)，丙氨酸注射1h和2h糖异生率明显降低(23.0％和38.5％)，肝糖原含量(3.87mg／g)明显升高。糖尿病模型对照组小鼠肝组织中GK mRNA水平明显下降，只是正常对照组小鼠的1.3％；G6pc mRNA水平明显上升，达到正常对照组小鼠的3.0倍；Gys-2 mRNA水平没有明显变化。WE灌胃处理，糖尿病小鼠肝GKmRNA水平明显升高，是模型对照组小鼠的6倍；G6pc mRNA水平呈下降趋势，Gys-2 mRNA水平呈上升趋势。结论番石榴叶水提取物可能通过调节糖尿病小鼠体内肝脏糖代谢关键酶基因表达和改善胰岛素分泌来提高组织对葡萄糖的吸收利用能力，促进肝糖原合成，减少糖异生，从而起到辅助降血糖作用。 2．3番石榴叶水提取物抗氧化和胰岛保护作用 目的研究番石榴叶水提取物(WE)抗氧化作用，观察WE对胰岛保护和损伤修复作用，为WE减轻机体组织氧化损伤提供依据。方法体外实验测定WE对羟自由基清除率和脂质过氧化抑制率。WE对肝脏糖代谢的调节作用研究(2.2)中小鼠脱颈椎处死，取肝组织测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和还原型谷胱甘肽(GSH)含量；取胰腺常规HE染色和胰岛素抗体免疫组化(HIC)染色，光学显微镜进行组织形态学观察和图像灰度分析，比较小鼠胰岛组织病理学变化。结果WE具有清除羟自由基和抑制脂质过氧化作用，呈剂量效应关系。与正常对照组小鼠相比，糖尿病模型对照组小鼠肝组织SOD水平(163.46U／mg protein)和GSH水平(27.96mg／g protein)明显下降，CAT水平(389.4U／g protein)呈下降趋势；WE灌胃处理后，糖尿病小鼠抗氧化能力提高，肝组织GSH水平(32.79mg／g protein)明显升高，SOD和CAT水平(199.23和411.7U／g protein)出现上升趋势。糖尿病小鼠胰岛出现明显的病理损伤，胰岛数量、密度、体积减少；胰岛内分泌细胞减少、细胞变性，胰岛素阳性表达的β细胞减少，胰岛素表达强度减弱。WE处理后，糖尿病小鼠胰岛病理损伤减轻，胰岛的数目和体积增加，表达胰岛素的β细胞数量增加，β细胞胰岛素表达强度增强。结论番石榴叶水提取物具有较强的抗氧化能力，通过保护糖尿病小鼠胰岛、减轻β细胞氧化损伤，恢复和改善β细胞合成分泌胰岛素功能，可能是番石榴叶水提取物辅助降血糖作用机制之一。 3番石榴叶提取物中辅助降血糖功效成分初步分析 目的初步探讨番石榴叶提取物辅助降血糖功效成分。方法紫外分光光度法分析番石榴叶水提取物(WE)、65％乙醇提取物(AE65)和95％乙醇提取物(AE95)中总黄酮含量，高效液相色谱(HPLC)和紫外可见吸收光谱法(UV)对黄酮类化合物初步鉴定；电感耦合等离子体—原子发射光谱法(ICP)测定提取物中Mg、Cr、V等矿物质含量。比较分析番石榴叶提取物中各成分含量与辅助降血糖效果之间关系。结果番石榴叶提取物主要含有槲皮素为苷元的黄酮类化合物，WE、AE65和AE95三种提取物总黄酮含量分别为3.28、30.71和55.98g／kg；WE中Mg、Cr、V等矿物质含量均比较高(分别为9259.08、11.41和49.54mg／kg)，AE65中三种矿物质较少，AE95中三种矿物质含量最低。结论番石榴叶提取物中黄酮类化合物和Mg、Cr、V等矿物质，它们可能均是辅助降血糖功效成分。 全文研究表明，攀枝花地区野生番石榴叶提取物具有辅助降血糖作用，其可能机制包括减缓肠道碳水化合物吸收、调节肝脏糖代谢及其关键酶基因表达、保护胰岛β细胞功能等方面，黄酮类化合物和镁、铬、钒等矿物质可能是其辅助降血糖功效成分。有待进一步明确辅助降血糖功效成分，进一步研究辅助降血糖作用机制，为番石榴叶资源的开发提供更充足的数据。