乌梅丸加减对溃疡性结肠炎大鼠IL-4/STAT6信号通路的调节作用

1.研究目的 溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)属于炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease,IBD),是一种病因尚未完全阐明的慢性肠道非特异性炎症,在我国的发病率有逐年上升的趋势。本病具有慢性和消耗性的特征,临床表现主要是腹痛、腹泻、黏液脓血便、里急后重,可能并发关节、皮肤等部位的症状,严重者可导致肠组织癌变。多数学者认为本病由多种因素相互作用所致,主要包括环境、微生物、免疫以及遗传等因素。目前,西医在药物治疗上以水杨酸偶氮磺胺类药物、肾上腺糖皮质激素、和硫唑嘌呤(免疫抑制剂)为主,但存在一定程度的不良反应,远期疗效常不尽人意。现在一些生物制剂正在崭露头角,但其价格昂贵,长期作用也尚待研究。 中医将UC归为“痢疾”、“泄泻”等病范畴,关于病因病机和分型有多种论述。我们认为本病为本虚标实、寒热错杂之证,脾虚为本,湿热瘀阻为标。病位在肠,与脾、胃、肝、肾密切相关,脾虚湿热贯穿疾病始终。因此,脾虚湿盛是UC的基本病机。近年来,中医药治疗UC的临床研究逐渐增多,显示出良好的疗效,其中大多为经方加减方、临床经验总结的自拟处方或院内制剂。 本课题通过文献研究总结了溃疡性结肠炎的临床用药规律。为了对文献研究的结果进一步验证,我们从调节IL-4/STAT6信号转导通路的方面,探讨中药复方治疗UC的机制,以期寻找中医药作用的新靶点,确立中药抗UC治疗的新思路和方法,为中药治疗UC寻找实验根据。 2.研究方法 采用聚类分析的方法,对近几年临床研究的文献进行统计学分析,探索总结溃疡性结肠炎常用有效中药、复方,归纳临床分型和配伍规律。确定实验的中药干预处方为乌梅丸(Black plum pill,BPP)及四君子汤合乌梅丸(Black plum pill uniting Decoction ofFour Mild Drugs,BUF)。 我们采用TNBS/乙醇法复制UC大鼠模型,并对模型进行评价。选用SD大鼠,随机分为正常组、模型组、柳氮磺胺吡啶组(sulfasalazine,SASP)、乌梅丸组、四君子汤合乌梅丸组。从疾病活动指数(disease activity index,DAI)、结肠黏膜损伤指数(colonmucosa damage index,CMDI)、结肠黏膜镜下病理形态学等方面,评价疗效;选取IL-4/STAT6信号通路上的四个关键因子IL-4、STAT6、SOCS1、eotaxin作为指标,探讨乌梅丸加减对溃疡性结肠炎大鼠信号通路的调节机制。采用ELISA检测大鼠血清中IL-4含量,免疫组化法检测大鼠结肠组织中STAT6、SOCS1和eotaxin含量。 3.结果 3.1处方研究 通过临床数据分析,结合临床经验,我们认为UC病机以脾虚湿盛、寒热错杂为主,证型可归结为寒热错杂,方药以四君子汤合乌梅丸为基础方。 乌梅丸和四君子汤分别是寒热错杂和脾气虚的代表方剂。乌梅丸具有温中祛寒、兼清湿热的功效,四君子汤具有健脾益气之功,两方合用可加强了乌梅丸补益的作用。从现代药理学角度分析,乌梅丸具有抗炎、抑菌、镇痛的作用,两方合用则在此基础上增加了四君子汤的免疫调节等作用。 3.2乌梅丸加减对TNBS型溃疡性结肠炎大鼠保护作用 研究数据表明,模型组DAI、CMDI显著高于正常组,本实验的溃疡性结肠炎模型复制成功。乌梅丸、四君子汤合乌梅丸对TNBS/乙醇所致的溃疡性结肠炎大鼠模型有良好的防治作用,两组的DAI、CMDI显著低于模型组。四君子汤合乌梅丸与乌梅丸相比,无明显的差异。 3.3乌梅丸加减对溃疡性结肠炎大鼠IL-4/STAT6信号通路的影响 试验结果提示,乌梅丸可以有效下调大鼠血清中IL-4含量以及结肠组织中STAT6和eotaxin的表达,上调结肠组织SOCS1的表达,各指标与模型组比较均有显著统计学差异。四君子汤合乌梅丸可以下调结肠组织中STAT6和eotaxin的含量,上调SOCS1的表达,与模型组比较有显著统计学差异;但两中药复方之间比较没有统计学意义;四君子汤合乌梅丸对血清IL-4的下调作用与模型组比较有统计学差异,但是不及乌梅丸明显。 4.结论 我们推测可能的机理是:UC病变黏膜Th1/Th2平衡被破坏,使得IL-4水平升高超过一定限度而成为促炎因子,异常激活STAT6,使其转位入核,激活下游的eotaxin表达,进而趋化嗜酸粒细胞到炎症部位;负反馈因子SOCS1表达水平受到抑制,进一步使STAT6的异常激活,加重炎症反应。乌梅丸加减通过抑制IL-4/STAT6通路上的IL-4、STAT6的过高水平,增强SOCS1表达,抑制eotaxin的表达而发挥治疗作用。SASP可以调节UC大鼠病变肠黏膜组织STAT6、SOCS1、eotaxin的表达,但对血清中IL-4水平无调节作用。本实验表明,两个中药复方对溃疡性结肠炎大鼠IL-4/STAT6信号通路具有一定的调节作用,但乌梅丸更侧重于对血清IL-4的调节,两方的作用靶点尚未证明有显著性差异,结合两个中药复方对UC防治作用,与文献统计的结果有出入,还需要进一步实验进行验证。 脾虚湿热是溃疡性结肠炎的主要病机。通过本实验,我们认为乌梅丸加减对TNBS/乙醇致溃疡性结肠炎大鼠有良好的保护作用。以温中祛寒、兼清湿热为主的乌梅丸、加强了益气健脾的四君子汤合乌梅丸都可以多靶点的调节IL-4/STAT6信号通路的异常活化。这表明中药复方具有对于信号通路网络的综合调节作用。但是,本实验尚不能证明四君子汤合乌梅丸强于乌梅丸对TNBS/乙醇UC大鼠的防治作用。对于实验结果与文献研究结果的差异还需要进一步的探讨。