白术多糖对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用

目的 本实验参照Ohmori等建立的70%大鼠肝脏缺血再灌注模型并在此基础上,对模型大鼠术前予白术多糖(Atractylodes Macrocephalaon Polysaccharide, AMP)预处理,通过对术后不同时间段肝细胞结构、功能的变化以及相关炎症因子的表达及其相互关系等的研究,观察大鼠肝脏缺血再灌注损伤后肝细胞显微和超微结构的变化,检测肝组织中ICAM-1mRNA、IL-1等的表达,探讨白术多糖对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用。从而为临床减轻肝脏缺血再灌注损伤提供理论依据和可能的技术路径。 方法 1实验分组：54只健康SD大鼠随机分为3组,每组18只,每个时间段6只。假手术组(Sham组)：大鼠麻醉成功后,取上腹部正中切口进腹,分离肝门后缝合关腹；缺血再灌注组(HIRI组)：大鼠麻醉成功后行肝脏缺血再灌注手术；白术多糖预处理缺血再灌注组(AMP组)：手术前两周给予白术多糖(按30mg/kg给药)灌胃,每天一次,大鼠麻醉成功后行肝脏缺血再灌注手术。 2比较大鼠缺血再灌注损伤后48h内的指标变化：分别于缺血60min后再灌注1h、6h、24h后切取肝左外叶及抽取下腔静脉血作为标本,检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST),肝组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平,Western blot分析肝组织中IL-1蛋白的表达情况,RT-PCR技术检测肝组织中ICAM-1mRNA的表达情况,观察肝细胞显微和超微结构的改变情况。 结果 1手术成功的标准是手术结束后,大鼠即刻苏醒,翻身,并能维持有效呼吸、心跳。 2血清ALT和AST水平的变化：血清ALT水平是临床反映肝细胞损伤和坏死程度的敏感指标,与Sham组比较,HIRI组以及AMP组的血清ALT和AST水平显著升高(P<0.05),血清转氨酶水平在再灌注6h达到高峰,然后逐渐下降,再灌注24h时血清ALT和AST水平均有所恢复。AMP组与HIRI组比较,血清ALT和AST水平显著降低(P<0.05)。 3肝组织MDA、SOD水平的变化：MDA能反映细胞膜脂质过氧化的程度,间接反映细胞损伤的程度；氧自由基清除剂SOD,可以间接反映体内氧自由基水平及脂质过氧化的损伤程度。与Sham组比较,HIRI组以及AMP组的肝组织MDA水平升高,SOD水平降低,差异具有显著性(P<0.05)；AMP组与HIRI组比较,肝组织MDA水平显著降低、SOD水平显著升高,差异具有显著性(P<0.05)。 4肝组织中IL-1蛋白表达：HIRI组和AMP组IL-1蛋白的表达较Sham组显著升高(P<0.05)。与HIRI组比较,AMP组IL-1蛋白的表达显著下降(P<0.05)。随时间延长其表达程度逐渐降低。 5肝组织中ICAM-1mRNA含量：HIRI组和AMP组ICAM-1mRNA含量较Sham组显著升高(P<0.05)。AMP组ICAM-1mRNA的含量较HIRI组显著下降(P<0.05)。随时间延长其增加幅度逐渐降低。 6肝组织HE染色观察：Sham组肝脏细胞形态正常,肝小叶、中央静脉、汇管区结构清晰,肝细胞索排列整齐。术后1h可见HIRI组中央静脉周围肝细胞轻度肿胀,但未见明显肝细胞变性坏死；AMP组肝细胞无明显损伤；6h可见HIRI组中央静脉周围肝细胞中重度水肿,局部可见气球样变性,肝血窦明显变窄、淤血,汇管区周围肝细胞重度水肿,可见较多炎性细胞浸润,AMP组肝细胞轻度水肿,未见明显肝细胞变性、坏死；24h后HIRI组可见肝细胞淤血水肿比1h、6h组好转,可见部分肝细胞发生凝固性坏死,AMP组肝细胞形态基本正常,肝细胞仅表现轻度水肿。 7各组肝组织超微结构的变化 7.1肝细胞在电镜下的变化：HIRI组：1h时段的肝细胞超微结构未见明显改变；6h时段肝细胞开始发生浓缩,细胞间隙变大,电子密度增高,细胞核皱缩变形,染色质粗糙,核仁浓缩甚至裂解,细胞器明显密集化；24h时段肝细胞呈现固缩死亡的形态,染色质边集,少数肝细胞内出现凋亡小体。与HIRI组相比,AMP组各时段的肝细胞未见有明显的凋亡形态。 7.2线粒体超微结构的变化：HIRI组各时段线粒体肿胀明显,膜模糊不清,部分膜破裂,线粒体嵴疏松溶解,有大量空泡形成；AMP组线粒体结构基本正常,仅有轻度肿胀,线粒体排列整齐,膜基本完整,线粒体嵴密集,无空泡形成。 结论 本实验结果提示ICAM-1的上调参与肝脏缺血再灌注损伤早期的炎症反应,加重肝脏损伤,可见缺血再灌注大鼠炎症因子IL-1的表达随着再灌注时间的延长而逐渐升高,ICAM-1也明显增加。而白术多糖可抑制缺血再灌注损伤大鼠肝脏IL-1过表达,并进一步抑制肝脏中ICAM-1的表达,减少缺血再灌注大鼠肝脏氧自由基的生成,通过降低MDA水平来降低肝细胞线粒体脂质过氧化损伤,并增强肝细胞清除氧自由基的能力从而调节线粒体功能,最终影响肝脏功能。这对防止或减少肝脏缺血再灌注损伤引起的细胞损伤具有重要参考意义。