佛甲草等景天属植物药中黄酮类物质的抗肿瘤活性研究及含量测定

佛甲草是一种常用草药及我国多民族用药，来源于景天科(Crassulaceae)景天属植物佛甲草（Sedum lineare Thunb.）的全草，曾收载于1977年版《中国药典》（一部），具清热解毒、消肿、止血功能，用于治疗咽喉肿痛、目赤、痢疾、漆疮、带状疱疹、痈肿、丹毒、烫伤、火伤及外伤出血。其同属植物垂盆草（S.sarmentosum Bunge）的干燥全草为较常用中药，多版中国药典收载。我国土家族地区均将佛甲草与垂盆草用于多种癌症治疗，幼嫩部分在产地还常作蔬菜食用。可见二者疗效广泛且药用安全，具有较高研究开发价值。在课题组前期研究基础上，笔者就佛甲草、垂盆草的总黄酮以及佛甲草中几种黄酮类单体化合物的体外抗肿瘤活性、抗肿瘤机理（对DNA拓扑异构酶I活性的抑制作用）进行了初步的研究；还通过高效液相色谱法（HPLC）测定了不同采收期的佛甲草及垂盆草、凹叶景天（S. emarginatum Migo）中黄酮类活性成分槲皮素和山柰素的含量，为佛甲草等植物药的质量控制提供了新的方法，并初步确定了3种药材的最适采收期。 课题组前期研究表明，黄酮类成分是佛甲草及其同属植物药垂盆草、凹叶景天抗肿瘤作用的主要活性成分，且总体上佛甲草的活性较好。为摸清佛甲草的具体抗肿瘤活性成分（群），对佛甲草、垂盆草总黄酮和从佛甲草中分离纯化出的7种黄酮类单体化合物：黄芪苷、木犀草素、槲皮素、化合物2、化合物4、化合物8、化合物11，以及上述各单体化合物按其在佛甲草中的大致比例混合的混合物，进行了体外抗肿瘤活性研究。考察了它们对4种肿瘤细胞即人肺癌细胞（A549）、人食管癌细胞（EC109）、人肝癌细胞（HepG2）、人口腔癌细胞（Accm）及一种正常细胞非洲绿猴肾细胞（vero）的增殖抑制作用。采用MTT法研究分析了各提取物对不同肿瘤细胞增殖的抑制程度。结果发现，佛甲草和垂盆草总黄酮及佛甲草中7种单体化合物（群）对体外培养的各肿瘤细胞及正常细胞均表现出不同程度的抑制作用,抑制率均随着提取物浓度的增加而增高，在测定的浓度范围内呈现一定的剂量依赖性。比较而言，化合物2对人肝癌细胞（HepG2）的抑制活性较好，且对正常细胞（vero）毒性很低；槲皮素及化合物11均对人肺癌细胞（A549）有较高抑制率；化合物4对各肿瘤细胞均有相对较强的抑制作用（但都不是最强）；佛甲草、垂盆草总黄酮对各肿瘤细胞的抑制作用均为最强。可见佛甲草中各黄酮类化合物是通过复杂的协同作用来发挥抗肿瘤活性的，除了上述7种单体化合物外，应还有其他黄酮类化合物协同地参与此抗肿瘤作用。 为探讨上述抗肿瘤活性成分的作用机理，又首先初步筛选了佛甲草、垂盆草各活性物质对DNA拓扑异构酶I（DNA Topo I）的抑制作用，发现槲皮素及化合物4的效果较好。再对两者的作用方式及机理进行了研究，结果表明，槲皮素和化合物4对Topo I有抑制作用，且均为拓扑异构酶阻遏剂。槲皮素是通过先与Topo I结合，阻止了Topo I与底物DNA的正常结合，从而发挥Topo I抑制作用；而化合物4可能既与Topo I结合又与DNA结合来发挥抑制拓扑异构酶I的作用。为了从分子层面上进一步考察槲皮素及化合物4抑制Topo I的作用机理，还进行了简单的分子对接实验。结果再次证明，槲皮素是通过先与Topo I结合从而发挥Topo I抑制作用的，并初步推测出了槲皮素与Topo I活性位点的结合方式。 采用高效液相色谱（HPLC）法测定了不同采收期的佛甲草的水解产物槲皮素及山柰素的含量，并对比测定了同属植物药垂盆草、凹叶景天不同采收期样品中槲皮素及山柰素的含量。结果发现，不同采收期3种药材样品中的槲皮素、山柰素含量及含量比差异较大，结合课题组前期对3种植物药中总黄酮含量随采收季节变化规律的研究结果，确定佛甲草、垂盆草及凹叶景天均以4月底至5月初盛花期采收为宜；且佛甲草、垂盆草中槲皮素的含量均明显高于凹叶景天，可能是前两者具有较强抗肿瘤活性的原因之一。 综上所述，本研究发现了佛甲草中的某些抗肿瘤活性物质，探讨了其抗肿瘤机理，为佛甲草等植物药的品质评价与质量控制提供了重要的实验依据，为从中寻找开发新的天然抗肿瘤药物资源奠定了一定的基础。