胆碱能抗炎通路在类风湿关节炎中的作用及机制研究

研究背景:类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种以累及周围关节为主的系统性炎症性自身免疫病,致残率高,是造成我国人群丧失劳动力和致残的主要疾病之一。近年研究表明炎症细胞因子网络在RA的滑膜炎症及骨质破坏中起到重要作用,是使RA病变持续存在、迁延进展的关键因素。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）-α和白介素（interleukin,IL）-1被认为是在RA发病过程中起主要作用的促炎因子。因而,采用多种途径抑制体内促炎因子成为探索RA治疗策略的主要思路,并已取得一些令人鼓舞的进展。然而,除了TNF-α拮抗剂因其疗效确切已经进入临床之外,大部分以细胞因子为靶标的干预措施还处于早期的动物试验或Ⅰ期临床;此外,也有一部分病人对TNF-α拮抗剂的反应欠佳;即使是反应性较好的病人,要获得RA的长期控制,也需持续用药,或需与经典的控制病情药物联用,否则将面临疾病的复发。这些结果促使人们尝试寻找新的抑制炎症介质的方法,以求取得更好的疗效。 新近研究发现:在中枢神经系统与免疫系统之间存在一条具有拮抗炎症反应作用的通路—胆碱能抗炎通路（cholinergic antiinflammatorypathway）,该通路由迷走神经及其递质乙酰胆碱和胆碱能受体所构成。大量动物实验结果表明刺激迷走神经和使用胆碱能激动剂烟碱和卡巴碱在内毒素血症、创伤、败血症等急性全身性炎症中可抑制TNF-α、IL-1、IL-6、HMGB1等炎症因子的生成和释放,抑制NF-κB信号通路,发挥抗炎作用。但该通路在慢性炎症性疾病RA中是否发挥抗炎作用及作用机制,目前国内外尚未见报道。本研究拟选用SD大鼠,RA患者原代滑膜细胞为主要材料,以佐剂性关节炎大鼠和WNF-α刺激滑膜细胞诱导炎症作为主要模型,观察胆碱能激动剂烟碱对佐剂性关节炎大鼠及TNF-α诱导的滑膜细胞炎症的影响,采用Western blot,RT-PCR,细胞间接免疫荧光,免疫组化,ELISA等研究手段从整体、细胞及分子水平探讨胆碱能抗炎通路对类风湿关节炎的影响。开展本项目研究,可望阐明胆碱能抗炎通路的在RA的抗炎作用及其分子机制,为RA以及其他炎症疾病的治疗提供新的思路和策略。 第一部分烟碱对大鼠实验性关节炎的保护作用及对炎症因子的影响 目的:探讨烟碱对佐剂性关节炎大鼠的炎症、关节破坏的干预作用和对炎症因子的影响。 方法:将64只SD大鼠饲养一周后,按体重匹配随机分为四组,正常组:注射生理盐水,每天两次;模型组:使用完全弗氏佐剂（CFA）造模,注射生理盐水,每天两次;大剂量烟碱组:使用CFA造模,腹腔注射0.2mg/kg的烟碱,每天两次;小剂量烟碱组:使用CFA造模,腹腔注射0.05mg/kg的烟碱,每天两次。从造模第1天开始腹腔注射。肉眼观察足肿胀并进行关节炎指数（arthritis index,AI）评分,组织病理学对滑膜炎,放射学和组织病理学对关节破坏进行评分,放射学评分采用Larsen评分标准。第37天处死所有大鼠,心脏采血,ELISA法检测血清TNF-α和IL-1β浓度,Western blot检测血清中HMGB1蛋白水平,免疫组化检测滑膜和关节中HMGB1表达。 结果: 1烟碱对佐剂性关节炎大鼠的保护作用:（1）造模第24天至32天,大剂量烟碱组关节炎发生率均低于模型组（P<0.05）;（2）从大鼠出现关节肿胀直至实验结束,大剂量烟碱组关节肿胀均比模型组轻,大剂量烟碱组AI均低于模型组（P<0.05）,小剂量组与模型组差异无显著性;（3）大剂量烟碱组放射学评分Larsen评分低于模型组（P<0.05）,小剂量烟碱组与模型组差异无统计学意义。（4）模型组和小剂量烟碱组滑膜中大量炎性细胞浸润,关节破坏明显,大剂量烟碱组滑膜炎性细胞浸润较轻,关节破坏较轻。大剂量烟碱组滑膜炎评分和关节破坏评分低于与模型组（P<0.05）。 2烟碱对全身炎症因子的影响:大剂量烟碱组血清TNF-α、IL-1β和HMGB1的含量较模型组显著降低（P<0.05）,但仍高于正常组（P<0.01）;小剂量组血清TNF-α、IL-1β和HMGB1的含量与模型组差异无统计学意义。 3烟碱对滑膜和关节局部炎症因子HMGB1的影响:正常组滑膜区和软骨及骨质区小部分细胞存在HMGB1表达,模型组和大小剂量烟碱组滑膜、软骨和骨质部位HMGB1表达明显增强。与模型组相比,大剂量烟碱组HMGB1表达强度显著降低（P<0.05）,小剂量烟碱组与模型组差异无统计学意义。 结论: 1烟碱可延缓佐剂性关节炎大鼠关节炎的发生和减轻关节肿胀,改善滑膜炎及骨质破坏。 2烟碱可降低佐剂性关节炎大鼠血清TNF-α、IL-1β和HMGB1水平。 3烟碱可抑制佐剂性关节炎大鼠滑膜和关节部位局部HMGB1的表达。 第二部分α7烟碱型乙酰胆碱受体在滑膜细胞表面的表达及烟碱对滑膜细胞炎症的影响 目的:探讨胆碱能抗炎通路对RA滑膜细胞炎症反应的作用及分子机制。 实验方法:培养RA原代成纤维样滑膜细胞（fibroblast-likesynoviocytes,FLS）,采用RT-PCR,Western blot,细胞间接免疫荧光鉴定鉴定FLS是否存在α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7 nicotinicacetylcholine receptor,α7nAChR）的表达。采用RT-PCR和ELISA观察烟碱对TNF-α诱导的FLS炎症因子IL-6和IL-8的影响,采用细胞间接免疫荧光和Western blot观察烟碱对TNF-α诱导的FLS炎症信号通路NF-κB和p38-MAPK通路的影响。 结果: 1α7nAChR在FLS中的表达:RT-PCR法显示FLS存在α7nAChRmRNA的表达,细胞免疫荧光技术显示α7nAChR定位于FLS表面,Western blot法显示FLS提取的膜蛋白中可检测到α7nAChR蛋白的表达。 2烟碱对FLS毒性实验:细胞活力MTT分析、乳酸脱氢酶释放率和胎盘兰实验显示低浓度烟碱(10-7-10-4mol/l)对FLS没有毒性,高浓度烟碱(10-3-10-2mol/l)对FLS呈现剂量依赖性毒性,能够导致细胞死亡。 3烟碱对TNF-α诱导的FLS炎症因子的影响:RA-FLS在20ng/ml的TNF-α刺激下,IL-6和IL-8分泌和mRNA表达明显增加（P<0.05）。10-1～10-5mol/l烟碱均可抑制TNF-α诱导的IL-6和IL-8分泌和mRNA表达,（P<0.05）。烟碱本身对IL-6和IL-8分泌和mRNA表达无影响。 4烟碱对TNF-α诱导的FLS炎症信号通路的影响:（1）正常情况下NF-κB（p65）位于FLS胞浆中,TNF-α刺激后p65移位进入细胞核。烟碱可抑制TNF所致NF-κB（p65）的核移位（P<0.05）。（2）烟碱对TNF-α诱导的p38的磷酸化无抑制作用,烟碱本身不诱导p38的磷酸化。 结论: 1 RA-FLS表面存在α7烟碱型乙酰胆碱受体的表达。 2低浓度的烟碱对RA-FLS无毒性作用。 3烟碱可抑制TNF-α诱导的RA-FLS炎症因子IL-6和IL-8的分泌和mRNA的表达。 4烟碱通过NF-κB通路抑制RA-FLS炎症因子的表达,对p38-MAPK通路无影响。