凉血止血药炒炭时黄酮类成分的变化规律与止血作用的相关性研究

中药制炭后用于止血距今已有两千年的历史,因其功效显著,至今仍广泛用于临床。“炒炭存性”最早记载于《金匮要略方论》,曰：“烧灰存性,勿令灰过”。宋元时代,开始有炒炭和煅炭的记载,但均要求“存性”。近现代认为炒炭存性是药物炮制成炭既应保存部分原有性质,又具有止血及其它治疗作用,方谓之存性。临床常用炒炭止血的中药按药性可分为凉血止血药、温经止血药、化瘀止血药、收敛止血药。而“出血者属热者十之八九”,故临床治疗出血,以凉血止血药应用较为广泛。此类药的生品清热凉血,炒炭后止血作用增强。大量文献分析总结发现,此类药物大部分含黄酮类成分,该类成分研究认为具有抗菌、消炎等作用。有研究提出黄酮类成分可能是大蓟、侧柏叶、蒲黄、槐花、荷叶等炒炭品的主要止血成分。文献发现侧柏叶、蒲黄、槐花炒炭后其所含黄酮苷的含量均下降,而黄酮苷元的含量升高,说明在炒炭过程中,黄酮类成分发生了转化。但这类成分转化与其止血作用之间是否具有相关性未见有相关研究。槐花、侧柏叶及蒲黄均为凉血止血药,黄酮类成分含量均较高,且炒炭后止血作用均显著增强,基于此,本论文提出这三种凉血止血药在炒炭过程中黄酮类成分的转化可能与药物止血作用增强有关,且其止血机理可能存在共性的假说。论文提取槐花、侧柏叶及蒲黄中的黄酮类成分,并进行模拟炒炭,从整体、离体、分子三个药理水平评价其止血效应,追踪炒炭后的止血活性成分,考察黄酮类成分转化与这三种药炒炭止血作用的相关性,结果表明,经炒炭后,这三种凉血止血药中黄酮类成分变化具有一定的规律,并发现了其产生的共有的止血活性成分,初步揭示炒炭止血的内在物质基础,并对其止血机制进行了探讨。本论文的主要内容及研究结果如下：1、槐花、侧柏叶及蒲黄总黄酮的提取及模拟炒炭方法的确定论文首先以60%乙醇回流提取,采用大孔吸附树脂法纯化富集获得三种所选止血药槐花、侧柏叶及蒲黄总黄酮。并以HPLC法测定槐花、侧柏叶及蒲黄总黄酮的纯度,分别为95.84%、89.82%及84.79%。为系统研究上述药物所含黄酮类成分在炒炭加热过程中的变化规律,将三种中药中提取分离获得的总黄酮部位模拟炒炭加热处理。按照《中国药典》规定的炒炭技术方法,并按照三种中药的实际炒炭工艺,选择在4种温度(150℃、200℃、250℃、300℃)下对三种药物进行炒制,并测定药物达到规定的炒炭程度所需时间,发现槐花和侧柏叶在250℃下、蒲黄在200℃所需时间适中,因此将槐花、侧柏叶中提取获得的总黄酮进行模拟炒炭温度选择以250℃为宜,而蒲黄总黄酮的模拟炒炭温度则选择200℃。同时,比较了三种模拟炒炭方法：总黄酮直接加热、总黄酮+空白饮片混合加热、总黄酮+硅藻土为载体填充条件下混合加热对黄酮类成分变化的影响差异,结果表明三种方法对总黄酮成分变化的影响无明显差异,考虑到以空白饮片和硅藻土为载体填充模拟炒炭加热对黄酮类成分的损耗严重且操作繁琐,故论文以总黄酮直接加热的方法对总黄酮进行模拟炒炭。2、谱效关系和柱层析联用追踪槐花、侧柏叶及蒲黄总黄酮模拟炒炭产物中的止血成分采用HPLC-MS/MS分析方法,对槐花、侧柏叶及蒲黄三种药物的总黄酮模拟炒炭不同加热时间产物进行化学组成分析,结果显示三种药物的黄酮类成分随着加热时间的延长,黄酮苷含量持续下降,黄酮苷元的含量先增加后减少,加热到一定时间可产生新色谱峰。采用整体动物实验,以鼠尾出血时间(BT)、凝血四项(APTT、PT、TT、 FIB)、优球蛋白溶解时间(ELT)及ADP、凝血酶、胶原诱导的血小板聚集为指标,考察黄酮类成分模拟炒炭不同加热时间产物止血作用的差异,结果表明,不同加热时间的产物能够通过缩短BT、APTT、PT及促进胶原诱导的血小板聚集发挥止血作用,对其他指标无显著性影响：止血作用呈先增强后减弱趋势,加热到某一时间的产物作用最强,槐花、侧柏叶总黄酮以分别加热10 min、12 min的产物止血作用最强。依据成分分析及止血活性的研究结果,论文采用典型相关分析建立谱效关系以追踪具有止血活性的色谱峰,研究三种药物加热后其中黄酮类成分组成变化与止血活性增强的相关性。结果发现槐花总黄酮加热产物中新生成的峰8、峰11及侧柏叶总黄酮加热产物中新生成的峰10、峰12与止血效应相关性最好,通过柱层析分离,并基于谱图分析确定结构,表明这些具有止血活性的新峰为新化合物,分别命名为huaicarbon A、huaicarbon B、cecarbon。槐花总黄酮模拟炒炭加热产生的是huaicarbon A/B,侧柏叶总黄酮模拟炒炭加热产生的是huaicarbon B及cecarbon,蒲黄总黄酮模拟炒炭加热也生成了huaicarbon A/B。通过体外促凝血实验和血小板聚集实验,进一步验证了这三个新化合物能缩短APTT、PT,促进胶原诱导的血小板聚集,并呈剂量依赖性,与谱效相关性研究结果一致。三种药物总黄酮模拟炒炭均产生了新化合物huaicarbon B,为其共性止血成分。3、新化合物huaicarbon A/B、cecarbon在槐花炭、侧柏炭、蒲黄炭中的含量测定及其止血作用研究采用HPLC-PDA法检测槐花炭、侧柏炭及蒲黄炭饮片中huaicarbon A/B、 cecarbon成分的含量,研究结果显示,自制的三种炭药中均能检测到该三种止血活性成分huaicarbon A/B、cecarbon。自制炭品因严格控制炮制过程,故含量较为稳定,而市售品中含量差异极大,有些市售炭药批次甚至不含有这三种成分。表明炒炭的炮制需严格控制炮制程度并会直接影响炭药炮制品中成分的组成。进一步研究考察了炒炭产生的新化合物是否是药物炭品发挥止血作用的物质基础。分别大鼠灌胃给药huaicarbon A/B以及三种药物炭品粉末,通过大鼠体内止血实验,以BT、APTT、PT、TT及ADP、凝血酶、胶原诱导的血小板聚集为指标,研究huaicarbon A/B与槐花炭、侧柏炭、蒲黄炭止血作用。结果表明,槐花炭、侧柏炭、蒲黄炭及huaicarbon A/B均能不同程度地缩短鼠尾出血时间,缩短APTT、PT、TT及促进三种诱导剂诱导的血小板聚集发挥止血作用。不含huaicarbon A/B及cecarbon的市售炭品,其止血作用显著弱于自制炭品和含huaicarbon A/B及cecarbon的市售炭品。上述实验结果不但验证了huaicarbon A/B具有体内止血作用,说明炒炭炮制工艺可直接影响炭品的体内药效,并且初步证实了“炒炭止血”及“炒炭存性”理论的科学性。为比较槐花炭与huaicarbon A/B止血作用的差异,huaicarbon A/B以槐花炭3组中的含量计算给药剂量,发现huaicarbon A/B能够缩短BT、APTT、PT,促进胶原、凝血酶诱导的血小板聚集,与槐花炭3组比较,huaicarbon A/B的BT、APTT、PT、胶原诱导的血小板聚集均无显著性差异,表明huaicarbon A/B是槐花炭3的主要止血药效成分之一；而其TT和ADP、凝血酶诱导的血小板聚集有显著性差异,表明药物中存在其他止血成分起到协同作用。4、槐花炭、侧柏炭、蒲黄炭中止血成分huaicarbon A/B的前体物质寻找为了探索槐花炭、侧柏炭和蒲黄炭中止血成分huaicarbon A/B的转化生成途径,寻求其前体物质,揭示黄酮类成分在炒炭过程中可能的转化机制,将槲皮素(异鼠李素)与鼠李糖(葡萄糖)以不同摩尔比置于马弗炉中进行加热反应,采用HPLC-MS/MS对加热反应产物进行分析验证。结果表明,槲皮素与鼠李糖在250℃/200℃反应即能转化生成huaicarbon A/B。增加鼠李糖的摩尔数能提高huaicarbon A/B的生成率,槲皮素与鼠李糖加热反应的最佳摩尔比为1：3,此时,huaicarbon A/B的生成率分别为25%和16%。为了保证较高的转化率,加热温度需控制在200℃-250℃范围内,加热时间也需严格控制(如250℃10-15min/200℃25-30 min)。槲皮素与葡萄糖、异鼠李素与鼠李糖/葡萄糖加热反应未能生成huaicarbon A/B.上述实验结果表明,槲皮素和鼠李糖是huaicarbon A/B的前体物质,它们在炒炭过程中能够形成huaicarbon A/B。5、Huaicarbon A/B、cecarbon促血小板聚集作用机制的初步研究采用体外血小板聚集实验,观察加入GPVI受体(主要的血小板胶原受体,主要功能是介导胶原诱导的血小板内信号转导及血小板活化,从而引起血小板聚集)特异性抑制剂前后huaicarbon A/B、cecarbon对人血小板聚集、胞内Ca2+水平的影响初步研究了huaicarbon A/B、cecarbon促进胶原诱导的聚集的作用机制。结果表明,huaicarbon A/B及cecarbon能够增加胞内Ca2+的累积,促进胶原诱导的血小板聚集,而这种作用能被GPVI受体特异性抑制剂阻断。Huaicarbon A/B及cecarbon通过激活血小板GPVI受体介导的信号通路促进胶原诱导的血小板聚集。6、结语论文提取分离槐花、侧柏叶及蒲黄中的黄酮类成分,以此为研究对象,采用直接加热模拟炒炭过程,考察炒炭过程中这三种药物所含黄酮类成分的变化,研究结果发现经炒炭后生成了三种新成分,并且这三种新成分是其炒炭后产生止血作用的物质基础之一。槐花、侧柏叶及蒲黄炒炭中黄酮类成分的变化存在共性规律：黄酮类成分经加热后黄酮苷含量下降,黄酮苷元含量先上升后下降,加热至某一时间点转化生成了新化合物huaicarbon A/B、cecarbon,再加热一段时间后其含量下降,直至消失。槐花炒炭加热过程中产生的是huaicarbon A/B,侧柏叶炒炭加热过程中产生的是huaicarbon B及cecarbon,蒲黄炒炭加热过程中也生成了huaicarbon A/B。Huaicarbon B为槐花炭、侧柏炭及蒲黄炭的共性止血成分。炒炭温度下生成的具有止血作用的成分huaicarbon A/B可能是由三种药物本身含有的槲皮素和鼠李糖在加热过程中生成。论文揭示了黄酮类成分与凉血止血药槐花、侧柏叶及蒲黄炒炭后产生止血作用的相关性,并从共性成分、共性效应的角度,揭示了凉血止血药槐花、侧柏叶及蒲黄炒炭止血、炒炭存性的科学内涵,为炭药止血理论研究提供合理的研究思路、方法。