PI3K/Akt信号介导缺血预适应在心肌梗死猪中抗心律失常及心功能修复作用

[研究背景及目的]急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction, AMI)已成为心血管疾病中死亡率不断增加的重要原因。心肌梗死后的恶性心律失常及心力衰竭是心肌梗死病人死亡的常见原因。心肌缺血预适应(Ischemic preconditioning, IP)是心肌在经过反复短暂的缺血再灌注后能预防或减弱随后长期有害的缺血再灌注损伤。研究表明缺血预适应可以抑制心室重构,减低心律失常的发生,减小心肌梗死面积,但至今机理尚未完全明确。有报道IP的心肌梗死后心肌保护作用与相关的血管生长因子的表达增强有关,如血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast Growth Factor, bFGF),缺血预适应的保护作用也取决于缝隙连接蛋白43 (connexin 43, Cx43)通道的形成,缝隙连接蛋白43缺乏降低了心肌对缺血再灌注损伤的耐受力,减弱了心肌梗死后缺血预适应减小心梗面积的保护作用。然而,连接蛋白43介导的保护作用与缺血预适应诱导的抗炎、抗心律失常作用与血管生成之间的确切潜在内在关系还有待建立。既往有研究表明,缺血预适应可以触发机体的保护机制,如使腺苷、缓激肽、内皮素等增加,通过相应受体激活“再灌注损伤补救激酶途径”(Reperfusion Injury Salvage Kinase, RISK)通路,包括磷脂酰肌醇-3-激酶／蛋白激酶B(phosphatidyl-inositol-3-kinase/protein kinaseB, PI3K/Akt)通路,导致效应器的基因转录和表达增加,从而发挥抗缺血再灌注损伤的作用。我们的前期实验表明缺氧微环境后促进血管新生,侧枝循环形成这些作用与PI3K/Akt通路有关。尽管P13K途径在缺血预适应中心脏保护作用至关重要,但PI3K/Akt信号通路在梗死心肌经过缺血预处理之后的抗心律失常作用的机理尚不十分清楚。我们对磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K/Akt)在缺血预适应中对连接蛋白43和促血管生成因子的影响进行探讨研究,特别是缺血预适应保护缺血诱导的心律失常,改善心脏功能及抑制心肌重塑的作用。在此,我们研究了不同的缺血模型的心脏保护作用与室性心律失常的发生及对心脏性猝死的影响,通过调控PI3K/Akt信号通路来确定是否连接蛋白43和血管生成因子参与这些影响因素,从而探讨缺血预适应在抗恶性室性心律失常及改善心功能方面的可能机制,为心肌梗死后心律失常及心力衰竭的预防与治疗提供新的思路。[研究方法]实验分组方法：在诱导心肌梗死(MI)模型前将研究中使用的90只实验小猪,随机选择10只正常实验小猪进行开胸手术和假结扎LAD冠状动脉,成为对照组。其他的80只实验小猪被随机分为接受局部肌肉注射磷酸盐缓冲盐水组(PBS)或局部注射P13K抑制剂LY294002组,其中的20只实验小猪被随机分配到接受IP或没有IP组。即将实验动物随机分为五组：CON(对照)组(N=10),LI(前降支结扎)组(N= 20), IPLI(缺血预适应+前降支结扎)组(N=20),LYLI(注射LY294002+前降支结扎)组(N=20),LYIPLI(注射LY294002+缺血预适应+前降支结扎)组(N=20)。研究方法：在实验开始前,将实验小猪行超声心动图检查,测LVEF、LVFS、 LVEDIVST、LVEDPW、LVEDV、LVESV、LVEDD和LVESD值,在诱导心肌梗死(MI)模型前,将研究中使用的90只实验小猪,随机选择10只正常实验小猪进行开胸手术和假结扎LAD冠状动脉,成为对照组。其他的80只实验小猪被随机分为接受局部肌肉注射磷酸盐缓冲盐水组(PBS)或局部注射P13K抑制剂LY294002组,其中的20只实验小猪被随机分配到接受IP或没有IP组。接下来,所有的动物进行左前降支结扎冠状动脉(LAD)诱导心肌梗死模型,术中及术后记录小猪发生心律失常情况,包括LAD结扎诱发首次恶性室性心律失常的时间间隔和12小时内恶性室性心律失常累计发作时间和次数。术后60分钟,予行心电图(ECG),超声心动图(UCG),冠状动脉造影(CAG)证实血管闭塞。并随访7天,经心超检查测得LVEF、LVFS、LVEDIVST、LVEDPW、LVEDV、 LVESV、LVEDD和LVESD值,通过TIMI评分判定各组侧枝循环情况。然后处死小猪,取出心肌。通过H&E染色法(H&E staining),氯化三苯基四唑染色法(TTC染色)和马森三色染色法(Masson's trichrome stain),探讨IP对心肌梗死后心肌组织重构,心肌炎症,梗死面积大小和胶原蛋白含量的影响。通过实时定量RT-PCR检测各组心肌梗死后7天Akt和缝隙连接蛋白43的mRNA水平。通过免疫印迹电泳显示各组Akt蛋白水平,磷酸化Akt Ser473表达水平,磷酸化Akt Thr308表达水平和连接蛋白43的水平,计算磷酸化Akt Thr3O8和磷酸化AktSer473与总Akt的各自比值。通过免疫组化观察在梗死区局部表达Akt和缝隙连接蛋白43的情况。通过实时定量RT-PCR,定量分析Ang-1、bFGF和VEGF 的 mRNA表达水平。蛋白免疫印迹检测各组结扎LAD后7天左心室梗死周围区域内的Ang-1、bFGF和VEGF蛋白的表达水平。通过免疫组织化学染色显示心肌梗死后7天各组VEGF、Ang-1、bFGF局部表达情况,应用血管因子VIII抗体染色分析心梗后各组梗死周边血管密度。[研究结果]1.在心肌梗死后7天,缺血预适应可以显著降低动物死亡率和恶性室性心律失常的发生。延长心梗后首次恶性室性心律失常发作间隔,缩短恶性室性心律失常累计发作时间。应用P13K抑制剂LY294002则取消这些作用。2.IP明显提高心梗后LVEF和LVFS,改善左室重构指标(LVEF、LVFS、 LVEDIVST、LVEDPW、LVEDV、LVESV、LVEDD和LVESD)。使用P13K抑制剂 LY294002则明显降低LVEF、LVFS值,加重左室重构。3.缺血预适应可以明显改善梗死心肌组织重构,表现为减少心肌的炎症反应和减小心肌梗死面积,减少胶原面积,增加梗死区域残存心肌存活数量。使用P13K抑制剂LY294002则使梗死心肌重构恶化,表现为增加炎症反应,胶原含量及心梗面积,减少梗死区域心肌存活。4.IP促进心梗后Akt表达水平增高,促进Akt磷酸化,上调心肌组织缝隙连接蛋白43表达,改善心肌重构,应用P13K抑制剂LY294002明显抑制Akt表达,降低Akt磷酸化及缝隙连接蛋白43表达。5.IP促进梗死心肌血管生长因子Ang-1、bFGF和VEGFmRNA及蛋白水平表达,而使用P13K抑制剂LY294002则降低这些因子表达。6.1P促进梗死心脏血管新生和侧枝循环形成,而使用P13K抑制剂LY294002则减弱这种作用。[研究结论]这些结果表明,IP的保护作用通过上调PI3K/Akt信号通路介导的连接蛋白43和促血管生成因子发挥抗室性心律失常和促进梗死心肌修复作用。