基于PI3K/Akt和GCGR/PKA通路探讨石斛合剂抑制糖异生的机制

目的本课题通过体内外实验探讨石斛合剂通过调控PI3K/Akt和GCGR/PKA信号通路改善肝脏胰岛素抵抗,抑制糖异生的作用机制。方法1.大鼠肝组织iTRAQ蛋白组学检测雌性Wistar大鼠40只,随机分为正常组10只和造模组30只。正常组予普通饲料喂养,造模组以高脂高糖饲料喂养6周后腹腔注射2次STZ(25 mg/kg +m2,间隔72 h)。筛选出糖尿病成模大鼠,再随机分为3组(模型组、石斛合剂组和二甲双胍组)。石斛合剂组以石斛合剂1号方(17.2 g/kg·d-l)和石斛合剂2号方(12.4 g/kg·d-1)灌胃,二甲双胍组以二甲双胍灌胃(100mg/kg·d),模型组、正常组用生理盐水灌胃,均持续灌胃60天。各组动物均于最后一次用药后24小时后剖腹取肝组织。利用以iTRAQ为标记的液相色谱质谱联用技术,对大鼠肝脏进行蛋白组学检测,定量观察各组大鼠肝脏的蛋白质差异表达情况,寻找组间的差异蛋白和相关信号通路,为后续研究打下基础。2.动物实验SPF级健康雌性Wistar大鼠50只,随机选取11只为正常组,其余39只大鼠按上述方法造模和分组干预,持续灌胃12周后采血取材。检测空腹血糖、血脂、糖化血清蛋白等指标;采用ELISA方法检测血清胰岛素、胰高血糖素;HE染色法观察肝组织形态。RT-PCR法检测PI3K/Akt和GCGR/PKA信号通路的肝糖异生相关基因表达情况。免疫组化法和Western-blotting法检测上述信号通路肝糖异生相关蛋白表达情况。3.细胞实验体外制备建立胰岛素抵抗肝细胞模型后,用MTT实验筛选的石斛合剂含药血清浓度进行干预。干预结束后,取细胞培养上清,葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法测培养液中残存葡萄糖水平,计算胰岛素敏感指数;提取细胞总RNA和蛋白,RT-PCR和Western-blotting法检测PI3K/Akt和GCGR/PKA信号通路相关的基因和蛋白表达。结果1.肝组织iTRAQ蛋白组学鉴定出的差异蛋白参与了能量代谢、碳水化合物代谢、脂肪代谢、氨基酸代谢等,所涉及的糖异生途径、脂肪酸代谢、氨基酸代谢等信号通路与肝糖异生直接或间接相关。2.模型组大鼠升高的FBG、GSP、Fins、HOMA-IR、Glucagon经石斛合剂干预后,显著下降(P<0.05或P<0.01)。二甲双胍干预后FBG、GSP、Fins、HOMA-IR显著下降(P<0.05或P<0.01),而Glucagon无明显改善。3.模型组大鼠升高的Tch、TG、LDL、AST、ALT水平经石斛合剂干预后,显著下调(P<0.05或P<0.01)。二甲双胍干预后Tch、LDL、AST、ALT显著下降(P<0.05或P<0.01),而TG无明显改善。4.肝组织HE染色结果显示模型组大鼠肝细胞形状改变,细胞轮廓不清,肝小叶失去索状排列,肝窦扩大。石斛合剂能明显改善肝形态学,效果好于二甲双胍组。5.石斛合剂能显著上调 InsR、β-catenin、TCF7L2 和下调 GCGR、PKA、FoxO1、PEPCK 和 G6Pase 的 mRNA 表达(P<0.05 或P<0.01);上调 InsR、p-PI3K、p-Akt、β-catenin、TCF7L2 和下调 GCGR、PKA、Fox01、PEPCK 和 G6Pase 的蛋白表达(P<0.05 或P<0.01),抑制糖尿病模型大鼠肝糖异生。6.石斛合剂含药血清能够显著提高IR肝细胞的摄糖能力(P<0.05),改善IR。7.石斛合剂含药血清通过上调InsR,下调FoxO1、PEPCK和G6Pase的mRNA表达(P<0.05 或 P<0.01);上调 InsR、PI3K、p-Akt、p-FoxO1,下调 FoxO1、PEPCK 和G6Pase的蛋白表达(P<0.05或P<0.01)来抑制IR肝细胞的糖异生。在加入PI3K的抑制剂Wortmannin后,这种作用减弱甚至消失。结论1.肝组织iTRAQ蛋白组学鉴定出的差异蛋白所涉及的与糖尿病相关的信号通路:如糖异生途径、脂肪酸代谢、氨基酸代谢和能量代谢等。这些信号途径都与肝糖异生直接或间接相关。2.石斛合剂能调节糖尿病模型大鼠糖脂代谢,改善胰岛素抵抗,改善肝脏形态学,促进肝脏功能恢复。3.石斛合剂能调控PI3K/Akt和GCGR/PKA途径关键信号分子的基因和蛋白的表达水平,抑制糖尿病模型大鼠肝糖异生。4.石斛合剂含药血清能够改善高胰岛素诱导的IR肝细胞的摄糖能力,改善胰岛素抵抗。5.石斛合剂含药血清主要是通过调控PI3K/Akt信号通路的基因和蛋白表达抑制IR肝细胞的糖异生。