聚N-乙烯基己内酰胺(PNVCL)是侧链为环己内酰胺基团的水溶性温敏聚合物,其LCST正好处于人体生理温度范围内。它不仅具有离子型水溶性、热敏感性,而且还具有生物相容性。由于聚合物大分子链上同时含有N和O的配位原子,它能与多种金属离子可以形成稳定的螯合物,可以广泛应用于金属离子亲和色谱。此外,它还在生物大分子的分离、浓集、固定化及药物的包埋和药物缓释等方面得到应用。
亲和沉淀是生物亲和相互作用与沉淀分离相结合的蛋白质类生物大分子的分离纯化技术,该方法被认为是分离纯化酶及其它蛋白质的有效手段。其优点是可以较为经济的多次回收利用蛋白质的亲和配基,可实现大规模、快速、特异性的分离纯化酶和其它目标蛋白质分子。
本论文采用了共聚-螯合金属离子的方法,将N-乙烯基己内酰胺(NVCL)单体和甲基丙烯酸(MAA)进行自由基共聚,使聚合物既具有温度敏感性能,同时又提供了可与金属离子螯合反应的羧基。然后在PNVCL-co-MAA共聚物上螯合二价铜离子,从而制得同时具有温度敏感性和亲和性的金属螯合亲和配基,并应用于蛋白质的亲和沉淀中。
论文主要内容包括：
以水作为反应溶剂,氧化-还原体系为引发体系,NVCL和MAA作为反应单体,合成了温度敏感聚合物PNVCL-co-MAA,其合成的最优条件为：NVCL浓度为4%(占溶液总质量)、MAA浓度为0.4%(占溶液总体积)、引发剂APS添加量为0.16%(占溶液总质量),制备得到的温敏聚合物具有较好的温敏特性,适合作为蛋白质分离纯化的载体。然后通过螯合配基金属铜离子,制备得到蛋白质的大分子亲和温敏配基PNVCL-co-MAA-Cu。通过实验优化,结果表明最佳配基螯合条件是：pH值为5.0,最佳铜离子初始浓度为2.0 mg/ml,时间为1小时。用紫外分光法检测温敏聚合物PNVCL-co-MAA对铜离子的最大吸附量为48.1mg/g。本论文制备的亲和温敏聚合物PNVCL-co-MAA-Cu在酸性及中性环境中具有良好的储存稳定性,溶剂适用范围较广。
以BSA为模型蛋白,研究了亲和温敏聚合物PNVCL-co-MAA-Cu对BSA的沉淀量和洗脱量的影响条件,并对其进行优化,得到的的最佳沉淀条件为：pH6.0,温度为10℃,BSA的初始浓度为1.0 mg/ml。在相同的BSA浓度下,三种不同的温敏聚合物对BSA的沉淀量的比较为：PNVCL< PNVCL-co-MAA< PNVCL-co-MAA-Cu。实验结果证明,BSA分子与亲和温敏聚合物PNVCL-co-MAA-Cu之间存在特异性的相互作用。亲和温敏聚合物PNVCL-co-MAA-Cu对BSA的最佳洗脱条件为：pH 4.0,0.05 M Tris-HCl缓冲液,其中含有0.20 M NaCl和0.06 M EDTA。
再生性实验表明,亲和温敏聚合物PNVCL-co-MAA-Cu可以多次循环利用,节省了很多资源,是一种环保、高效、性能优异的亲和分离介质。
