调气消积汤对Lewis肺癌小鼠抑瘤作用的实验研究

目的: 肺癌是我国常见的恶性肿瘤之一,严重威胁人类的健康与生命。针对肺癌的致病特点,我们根据多年的临床实践,筛选有效药物组方而成的调气消积汤具有调畅气机、清热解毒、软坚散结、活血化瘀的功效,在治疗中重视升降理论的应用,注重人体气机运动的调畅,是临床治疗肺癌的有效方剂。本课题以中医“气机升降”理论为指导,以小鼠Lewis肺癌移植瘤型作为体内试验研究对象,从生存质量、肿瘤抑制率、免疫功能、移植瘤细胞凋亡以及血管生成等方面探讨调气消积汤抗肺癌的作用及机制,从而为临床应用调气消积汤治疗肺癌提供科学理论依据。 材料和方法: 将48只近交系C57BL/6小鼠常规接种Lewis肺癌,5天后选取荷瘤成功的小鼠随机分四组:荷瘤对照组(MG)、调气消积汤组(TG)、顺铂组(DG)、综合组(调气消积汤+顺铂组)(ZG),每组10只;健康的10只小鼠组成空白对照组(CG)。每天分别予饮用水、调气消积汤各0.4ml灌胃12天;隔日一次腹腔注射生理盐水、顺铂0.13ml共3天。停药后24小时取材。观察各组小鼠日常生活状况和肿瘤生长情况,用H.E.染色法通过光镜观察肿瘤组织病理形态改变。观察调气消积汤对脾脏指数的影响,应用形态学方法计数小鼠外周血T淋巴细胞转化率,MTT比色法检测小鼠脾T淋巴细胞的增殖情况,用Western Blot法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达。应用电镜技术与TUNEL法检测调气消积汤对Lewis肺癌小鼠肿瘤细胞凋亡的影响,用Western Blot法检测突变型P53、Bcl-2基因蛋白的表达。应用Western Blotting法检测Lewis肺癌小鼠肿瘤组织的微血管密度(MVD)、血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达的影响。 结果: 1.从体重、进食量、小鼠的反应性来看,调气消积汤能改善Lewis肺癌小鼠一般状况,五分钟自主活动及站立次数增加,与荷瘤对照组比差异有统计学意义(P<0.01),与空白组比无明显差异(P>0.05);其中顺铂组基本丧失站立能力,表现最差。 2.光镜下观察,各实验组与荷瘤对照组比较,肿瘤细胞体积变小,异型细胞较少,细胞核致密,染色质浓缩边集,病理性核分裂较少;间质可见较多的淋巴细胞等炎性细胞浸润,毛细血管内肿瘤细胞少见,周围坏死灶面积增大。 3.调气消积汤组、顺铂组和综合组的瘤重均低于荷瘤对照组,差异显著(P<0.01),三组的抑瘤率分别为29.37%、71.23%和75.19%,说明调气消积汤具有抑制肿瘤生长的作用,与顺铂合用后抑瘤作用明显增强。 4.荷瘤对照组的脾脏指数明显升高,是空白对照组的111.54%,差异显著(P<0.01);调气消积汤可使荷瘤小鼠的脾脏指数降低并趋向正常,与空白组比较无统计学意义(P>0.05);顺铂组和综合组的脾脏指数明显降低,分别是空白对照组的36.55%和54.62%。 5.从小鼠外周血T淋巴细胞转化率及脾T淋巴细胞增殖活性来看,荷瘤对照组明显低于空白对照组,且二者相比较,差异显著(P<0.01或P<0.05);而调气消积汤组比荷瘤对照组明显升高,差异显著(P<0.01),与空白对照组相比差异无统计学意义(P>0.05);顺铂组最低,与空白对照组及荷瘤对照组相比差异显著(P<0.01)。说明提调气消积汤能提高荷瘤小鼠的免疫功能。 6.Western Blotting法结果显示,顺铂组及综合组均可升高Lewis肺癌移植瘤组织中TNF-α蛋白的表达,与荷瘤对照组比较有显著性差异(P<0.01);而调气消积汤组与荷瘤对照组比较无明显差异(P>0.05)。 7.电镜下观察,可见细胞凋亡的特异性标志——凋亡小体形成。 8.TUNEL原位法检测结果显示,荷瘤对照组凋亡形态的细胞较少见,绿色荧光强度低;各治疗组与荷瘤对照组相比凋亡细胞明显增多,绿色荧光强度高;尤以综合组增多最为明显。说明调气消积汤与顺铂合用可增强促肺癌细胞凋亡的能力。 9.Western Blotting法结果显示,调气消积汤组、顺铂组及综合组均可降低突变型p53蛋白的表达,其灰度值与β-actin的比值分别为:(0.752±0.006)、(0.723±0.008)、(0.721±0.011),与荷瘤对照组(0.777±0.008)相比,差异有统计学意义;其中综合组的突变型p53蛋白表达最低。各实验组Bcl-2蛋白的表达情况与突变型p53相同。 10.Western Blotting法结果表明,各治疗组的MVD、VEGF和MMP-9蛋白的表达均低于荷瘤对照组,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);调气消积汤组MVD、VEGF和MMP-9蛋白的表达与顺铂组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。 结论: 1.调气消积汤可以改善荷瘤小鼠的一般生活状况,对Lewis肺癌有抑制作用,与化疗合用后抑瘤效果明显增强。 2.调气消积汤对Lewis肺癌小鼠的免疫器官(脾)有一定的保护作用;可以通过提高荷瘤小鼠外周血T淋巴细胞转化率、脾T淋巴细胞增殖活性,来增强荷瘤小鼠的免疫功能;对肿瘤组织中TNF-α蛋白的表达无明显促进和抑制作用。 3.调气消积汤能促进Lewis肺癌小鼠肿瘤细胞凋亡,与化疗药物合用能增强促肺癌细胞凋亡的能力;下调凋亡相关基因突变型p53、Bcl-2的表达水平,可能是调气消积汤发挥抑瘤作用的分子机制之一。 4.调气消积汤能降低Lewis肺癌移植瘤的微血管密度(MVD);并通过下调移植瘤中血管内皮生长因子(VEGF)及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达,来发挥抑制肿瘤血管形成、抗肿瘤的作用。