脾气虚证大鼠MTL、AQP4、胃蛋白酶及蛋白质组学改变的实验研究

脾为水谷之海,气血生化之源,是人体赖以生存的仓度,故“脾为后天之本”,脾虚证,是以一系列消化和吸收障碍为主的综合征,脾气虚证,是脾虚诸证衍发的根本证型,脾虚证的现代研究一直是中医基础理论研究的重要内容，目前具有特异诊断功能的指标极少,蛋白质组学是全面研究细胞、组织乃至整个生命体内蛋白质组成及其活动规律的科学,近年来,蛋白质组学快速发展,已经成为生命科学研究的一个新领域,借助其有力的理论与技术支持，将蛋白质组学引入到脾虚证的研究中,将对该证的研究带来突破性的进展。本实验以脾气虚证为模型,采用健康组为对照,探讨脾气虚证发生的作用机制。 目的： 本研究旨在血清胃动素(MTL)、水通道蛋白4(AQP4)、胃蛋白酶和蛋白质组学方面探讨脾气虚证的作用机制，通过观察分析脾气虚证大鼠MTL、AQP4、胃蛋白酶以及蛋白质组学方面的改变,探讨该证发生时机制的异常改变,为研究脾气虚证本质及采用补中益气汤治疗脾气虚证提供科学实验依据。 材料与方法： 选用SPF级SD大鼠36只,采用饮食不节(单日喂饲甘蓝,双日喂饲猪油)加劳倦过度(游泳至耐力极限)方法塑造脾气虚证大鼠模型,同时给与中药补中益气汤、生理盐水灌胃干预。采用ELISA方法测定各组大鼠血清中MTL的含量变化、免疫组化方法检测大鼠回肠中AQP4的差异表达、比色法测定大鼠十二指肠中胃蛋白酶的活性改变,光镜下观察各组大鼠的胃、肠组织的形态学改变,及采用蛋白质组学技术的方法鉴定健康对照组与模型组的差异蛋白点。 结果： 1.采用饮食不节加疲劳过度的方法塑造脾气虚证大鼠模型,造模后大鼠出现形体逐渐消瘦.大便时软时干,偶有便溏,进食量、饮水量减少，倦怠懒动,眯眼弓背等症状：经第8天给药后,脾气虚中药组大鼠便溏,懒动,眯眼弓背等症状有所缓解。 2.血清MTL的ELISA检测结果：脾气虚模型组与中药组的MTL含量和健康对照组相比明显降低,出现显著性差异(p<0.05)：脾气虚中药组的MTL含量较模型组升高明显,出现显著性差异(p<0.05)。 3.AQP4的免疫组化检测结果：在200倍光学显微镜下观察，AQP4在正常表达下呈深棕色阳性颗粒,且数量较多；与健康对照组相比,模型组AQP4的阳性颗粒数目变少,且颜色呈现较浅棕色；与模型组相比,中药组AQP4的阳性颗粒数目表达明显增多,呈现较深的棕色。 4.胃蛋白酶的检测结果：脾气虚模型组与中药组的胃蛋白酶含量跟健康对照组相比明显降低,出现显著性差异(p<0.05)：脾气虚中药组的胃蛋白酶含量较模型组升高明显,出现显著性差异(p<0.05) 5.蛋白质组学鉴定出的差异蛋白：脾气虚模型组与健康对照组相比有3个相关差异蛋白,其中2个上调,1个下调。上调的2个蛋白分别为葡萄糖调节蛋白78(13/A13:Hspa578kDa glucose-regulated protein)、(?)夷蛋白酶(104/E3:Prssl Anionic Trypsin-1)、白蛋白(114/E13:Alb Serum albumin),下调的1个蛋白为白蛋白(20/A20:Alb Serum albumin)。 结论： 采用饮食不节加疲劳过度方法塑造的脾气虚证大鼠模型造模成功，经研究发现,该模型模型组与中药组大鼠较健康对照组相比MTL含量降低,AQP4阳性表达降低.胃蛋白酶含量降低：采用补中益气汤中药治疗后,中药组大鼠与模型组大鼠相比MTL含量明显升高,AQP4阳性表达升高,胃蛋白酶含量升高：应用蛋白质组学技术鉴定后发现，模型组与对照组相比有3个相关差异蛋白,其中2个上调、1个下调,上调的2个蛋白为葡萄糖调节蛋白78、胰蛋白酶,下调的1个蛋白为白蛋白,这些蛋白的异常表达可能与脾气虚证发生的分子生物学机制有关。