线粒体氧化应激在糖尿病大鼠骨骼肌病变机制中的作用

目的： 1．探讨线粒体氧化应激在糖尿病骨骼肌病变中的作用。 2．探讨解偶联蛋白UCP-3在线粒体氧化应激中的调节作用。 3．探讨线粒体氧化应激加重胰岛素抵抗的机制。 4．探讨抗氧化剂α-硫辛酸(α-LA)的干预效果及干预机制。 方法： 一．1型糖尿病大鼠的干预治疗 1．一次性尾静脉注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)(45 mg／kg体重)制备糖尿病大鼠模型。 2．将实验动物分为四组：正常对照组、糖尿病组、胰岛素治疗组、糖尿病α-LA干预组(硫辛酸组)，每组又分三个阶段处死(4周、8周、12周)。胰岛素组每天皮下注射PZI(6U／Kg体重)，硫辛酸组每天腹腔注射α-LA(100 mg／kg体重)。 3．血生化指标的测定：测定各组大鼠血糖、糖化血红蛋白、血脂和血游离脂肪酸。 4．HE、Masson染色观察各组大鼠骨骼肌的病理变化。 5．透射电镜检测骨骼肌超微病理改变。 6．差速离心法提取骨骼肌组织的线粒体，应用TBA(thiobarbituric acid)法测量线粒体中丙二醛(Maleic Dialdehyde,MDA)含量，比色法测量线粒体中锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性及还原型谷胱甘肽(GSH)含量。 7．利用免疫组化技术测量骨骼肌组织中半胱天冬酶-3、Bcl-2／Bax表达的变化。 8．利用半定量逆转录聚合酶链反应(SQ-RT-PCR)、Western印迹技术检测线粒体中Mn-SOD和UCP3的表达水平。 二．2型糖尿病大鼠的干预治疗 1．高脂饮食和高脂饮食加尾静脉注射小剂量链脲佐菌素(30 mg／kg体重)制备高脂和2型糖尿病大鼠模型。 2．将实验动物分为四组：正常对照组、高脂组、2型糖尿病组、2型糖尿病干预组(硫辛酸组)。 3．检测血浆中胰岛素水平、毛细血管法测定胰岛素敏感性。 4．利用免疫组化技术测量骨骼肌组织中GLUT-4的表达。 5．每次处死动物前在麻醉状态下颈动脉插管测量大鼠主动脉收缩血压(SBP)和舒张压(DBP)。其余检测指标同1型糖尿病大鼠。 结果： 一．1型糖尿病大鼠 1．STZ制备糖尿病大鼠模型成功率86.4％。 2．一般情况的比较：糖尿病组、胰岛素组、硫辛酸组大鼠的体重低于对照组，而血糖、糖化血红蛋白高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)；糖尿病组和硫辛酸组血糖、糖化血红蛋白、体重差别无统计学意义(P＞0.05)，胰岛素组血糖、糖化血红蛋白明显低于糖尿病组、硫辛酸组(P＜0.01)，体重明显高于后两组(P＜0.01)，几组间血脂、游离脂肪酸差异无统计学意义(P＞0.05)。 3．线粒体氧化应激结果：正常对照组大鼠氧化应激指标无改变，糖尿病组GSH的含量随病程进展逐渐下降，Mn-SOD活性和CAT活性在4周时无变化，8周、12周时下降，而MDA的含量随病程进展逐渐增加，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与糖尿病组比较，应用α-LA和胰岛素干预均可使同期的GSH含量、CAT活性和Mn-SOD的活性上升，MDA含量下降，胰岛素组改变更为明显。 4．病理结果：与对照组比较，糖尿病组大鼠可见普遍性肌萎缩，肌纤维排列紊乱，肌间隙增宽，超微病理检测发现，糖尿病组4周时出现线粒体数量增多、肿胀等代偿表现，随病程进展，线粒体嵴断裂或溶解，线粒体髓样化，出现局灶性肌丝溶解，Z盘变形及模糊不清，肌细胞核异染色质增多，肌细胞膜呈锯齿状突起，肌纤维间的微血管管腔变窄，内膜明显突起，基底膜增厚等表现。Masson染色显示骨骼肌胶原组织含量随病程延长明显增加，α-LA干预可以改善上述结构的紊乱，胰岛素治疗组无明显肌萎缩。 5．Bcl-2／Bax和cas-3表达的变化：与对照组比较，糖尿病组Bcl-2表达明显下降，Bax表达随病程逐渐增加，Bcl-2／Bax逐渐降低，cas-3表达随病程逐渐增加，胰岛素和α-LA干预可在一定程度上减弱这种改变，上述变化均有统计学意义。 6．Mn-SOD和UCP3 mRNA和蛋白质表达的变化：与对照组比较，4周时糖尿病组Mn-SOD和UCP3 mRNA和蛋白质表达稍高于正常对照组，但无统计学意义，8周、12周时表达明显下降(P＜0.05)，胰岛素和α-LA干预可在一定程度上提高Mn-SOD和UCP3 mRNA和蛋白质的表达(P＜0.05)。 二．2型糖尿病大鼠 1．2型糖尿病病大鼠模型成功率73.3％。 2．一般情况的比较：高脂喂养4周后，大鼠体重、TG、TC、FINS、FFA、HOMA-IR明显高于对照组(P＜0.05)，KITT明显低于对照组(P＜0.05)，血糖有增高趋势，但无统计学意义(P＞0.05)。注射STZ后，与对照组相比，糖尿病组血糖升高，体重下降，TG、TC、FFA、HOMA-IR、SBP、DBP水平明显高于其他三组(P＜0.05)，KITT明显低于对照组(P＜0.05)，硫辛酸组干预后上述指标明显改善。高脂组各项指标介于糖尿病组和对照组之间。 3．线粒体氧化应激结果：与正常对照组比较，高脂组和2型糖尿病组GSH的含量、Mn-SOD活性和CAT活性下降，而MDA的含量增加，糖尿病组上述指标变化更明显(P＜0.05)。2型糖尿病大鼠应用α-LA干预后可使GSH含量、CAT活性和Mn-SOD的活性上升，MDA含量下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。 4．病理结果：与对照组比较，2型糖尿病组大鼠可见轻度肌萎缩，光镜和电镜下均可见脂肪浸润，在肌纤维间和肌纤维内部均见比较明显的脂肪变性，在一些肌纤维横断面上，可见肌纤维内部的大部分空间被脂肪滴所占据。α-LA干预可以改善上述结构的紊乱。 5．Bcl-2／Bax和cas-3表达的变化：与对照组比较，糖尿病组Bcl-2表达有下降的趋势，Bax表达增加，Bcl-2／Bax降低，cas-3表达也有增高趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05)；α-LA干预可在一定程度上减弱这种改变，高脂组上述指标变化不明显。 6．GLUT-4蛋白表达的改变：糖尿病组GLUT-4表达低于正常对照组，α-LA干预后可以提高GLUT-4蛋白表达(P＜0.05)，高脂组与正常对照相比，GLUT-4表达有下降趋势，但无统计学差异(P＞0.05)。 结论： 1．1型糖尿病状态下，骨骼肌线粒体氧化应激损伤明显增加，诱发肌细胞凋亡，导致普遍性萎缩。 2．2型糖尿病状态下，骨骼肌线粒体氧化应激加重胰岛素抵抗，胰岛素抵抗进一步加重骨骼肌病变。 3．抗氧化剂能够通过增加抗氧化酶如Mn-SOD和CAT活性来减轻骨骼肌线粒体氧化损伤；同时能够改善胰岛素抵抗，主要是通过增加胰岛素信号通路中GlUT-4蛋白表达来实现的。