中国重庆非糖尿病性重度冠心病血清线粒体DNA T16189C巢式PCR-RFLP多态性分析

目的 建立巢式-多聚酶链反应-限制性片段长度多态性分析（nested-polymerase chain reaction-restriction fragment lengthpolymorphism, nested-PCR-RFLP）方法检测血清线粒体DNA T16189C(mitochondrial DNA T16189C, mtDNA T16189C)变异，分析T16189C多态性与重庆地区非糖尿病性(non-diabetes mellitus，non-DM)重度冠心病（coronary heart disease, CHD）的相关性。 方法 1.建立血清DNA的提取方法，设计针对mtDNA T16189C变异位点的外套引物和内套引物，分别以内套引物行常规PCR，以内、外套引物行nested-PCR扩增目的基因，电泳确认血清mtDNA提取成功，并比较两种方法对血清mtDNA检测的敏感性。nested-PCR产物经RFLP和测序鉴定确认mtDNA T16189C变异位点，并对nested-PCR-RFLP进行方法学评价。 2.收集中国重庆地区82例非糖尿病性重度CHD患者血清及对应临床资料，50例非糖尿病、非冠心病受试者血清作为对照。提取血清DNA，联合应用常规PCR及nested-PCR评估不同组别血清mtDNA含量的高低。利用建立的nested-PCR-RFLP方法检测mtDNAT16189C变异位点，分别比较mtDNA含量、mtDNA T16189C变异与该类人群的相关性，并进一步分析非糖尿病性重度CHD不同mtDNA含量组间mtDNAT16189C变异情况。 结果 1.血清mtDNA的提取和nested-PCR-RFLP方法的建立及评价：（1）成功建立了血清mtDNA提取和血清mtDNA的nested-PCR-RFLP方法，通过实验优化得到PCR和酶切反应的最佳条件，经RFLP和测序鉴定与预期结果一致。（2）nested-PCR电泳检测Qiagen试剂盒所提200μl人类血清的mtDNA的敏感性为100%，nested-PCR-RFLP检测血清mtDNAT16189C多态性简单快速、特异性和敏感性均高。 2.血清mtDNA浓度及mtDNA T16189C变异与非糖尿病性重度CHD危险因素的相关性分析：（1）血清mtDNA含量在非糖尿病性重度CHD患病组显著低于健康对照组（χ2=9.979, P<0.05，OR＝0.318，95%CI：0.153～0.660）；在患病组中，女性高于男性，并随年龄增加而增加，高LDL-c组低于正常组、吸烟低于非吸烟组（P<0.05）；在血压、HDL-c、TC、血糖调节各组内差异无统计学意义（P>0.05）。多因素非条件logistic回归分析结果显示：吸烟（OR＝3.70；95%CI：1.285～10.870）是导致血清mtDNA浓度减低的主要影响因素。(2)mtDNA T16189C变异率在非糖尿病性重度CHD组（32.93%）高于健康对照组（22%），但差异无统计学意义（P>0.05）；在重度CHD病人中，合并血糖调节受损（impired glucose tolerance，IGT）者明显高于血糖正常者和健康对照（P<0.05），但血糖正常重度CHD组和健康对照组差异无统计学意义（P>0.05）；在重度CHD病人中，合并高血压者高于血压正常重度CHD组和健康对照组（P<0.05），但血压正常重度CHD组和健康对照组间差异无统计学意义（P>0.05）。重度CHD组内及其与对照组之间，mtDNAT16189C变异率与性别、年龄、吸烟、LDL-c、HDL-c、TC等因素均无关，差异无统计学意义（P>0.05）。非条件logistic回归分析结果显示：高血压（OR＝3.265；95%CI：1.061～10.06）是导致血清mtDNA T16189C变异的主要影响因素。（3）非糖尿病性重度CHD患者血清mtDNA T16189C变异率在mtDNA高浓度组显著高于低浓度组（χ2=5.612, P<0.05；OR＝3.154，95%CI：0.197～8.307）。 结论 成功建立了血清mtDNA T16189C的提取及nested-PCR-RFLP方法，可作为循环mtDNA基因多态性和相关性流行病学研究的重要工具之一。 非糖尿病性重度CHD患者血清mtDNA含量显著低于健康对照，且女性组高于男性组、高龄组高于低龄组、高LDL组低于正常组、吸烟低于非吸烟组；并且吸烟是导致血清mtDNA浓度减低的主要影响因素。mtDNA T16189C变异率与血糖调节受损（IGT）和高血压有关，高血压是导致血清mtDNA T16189C变异的主要影响因素，并与血清mtDNA浓度高低有关。