高脂血症合并急性脑缺血再灌注诱导大鼠肝损伤机制的研究

目的:研究急性脑缺血损伤对高脂血症所致大鼠肝损伤的影响及机制。 方法: 1.实验分组：空白对照组（control）、单纯高脂血症组（hyperlipemia, HL）、单纯脑缺血再灌注组（acute cerebral ischemia/reperfusion injury, I/R）及高脂血症合并脑缺血再灌注组（HL+I/R）。 1.1建立大鼠高脂血症模型:对照组和I/R组以正常饲料喂养，HL组和HL+I/R组连续喂养高脂饲料18周，每天称量大鼠体重，每周取大鼠尾部静脉血液检测血清甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白，观察高脂血症模型是否构建成功。 1.2建立大鼠大脑中动脉局灶性缺血/再灌注（middle cerebral artery occlusion, MCAO）模型:将合格的高脂血症大鼠随机分为HL组及HL+I/R组，并对I/R组及HL+I/R组大鼠实施MCAO手术。脑缺血2h再灌注24h后，用2,3,5氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazoliumchloride，TTC）染色法检测各组脑组织梗死面积，用Longa’s评分法对大鼠神经学行为进行评分，以评价MCAO模型是否成功。将脑梗死体积及神经功能评分结果与空白对照组相比有统计学差异（p<0.05或p<0.01）的大鼠纳入进一步的实验。 2.以血浆谷丙转氨酶（alanine aminotransferase, ALT）和谷草转氨酶（aspartateaminotransferase,AST）水平、肝脏切片HE染色，评价高脂血症和/或脑缺血再灌注对肝脏损伤状态的影响。 3.以各组动物血清炎性细胞因子TNF-α和IL-1水平反映炎症状态；差速离心法分离肝脏线粒体及微粒体，检测线粒体超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性、丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平、谷胱甘肽过氧化酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）和Ca~(2+)的含量；测定肝微粒体细胞色素P4502E1（CYP2E1）依赖性苯胺羟化酶活性、免疫组化及Western blot法检测肝组织中CYP2E1的表达，以确定高脂血症大鼠在急性脑缺血再灌注状态下氧化还原系统的变化。 4.TUNEL法检测肝细胞凋亡；免疫组化和Western blot法检测肝组织中凋亡相关因子bcl-2和caspase-3表达,以观察高脂血症合并缺血再灌注脑损伤对肝细胞凋亡的影响。 结果: 1.大鼠高脂血症合并缺血再灌注脑损伤模型构建：大鼠高脂饲料连续喂养18周后，高脂饲料喂养组大鼠体重、甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白与空白对照组相比有明显差异（p<0.05）;脑缺血2h再灌注24h后，I/R及HL+I/R组神经行为评分和脑梗死体积与空白对照组及HL组相比具有统计学差异（p<0.05或p<0.01），显示大鼠高脂血症及缺血再灌注脑损伤模型构建成功。 2.与对照组相比，血清AST、ALT水平在HL组显著升高（p<0.05或p<0.01）；I/R组无显著变化；而HL+I/R组血清AST、ALT水平显著升高，与对照组、HL组和I/R组相比均有显著差异（p<0.01），提示I/R加重HL所致大鼠肝损伤。（2）肝组织切片HE染色结果显示，对照组及I/R组肝组织无显著损伤，HL组肝细胞呈现脂肪浸润性病变，HL+I/R组肝组织损伤最为严重。 3.炎症反应及肝脏氧化应激状态：（1）缺血2h再灌注24h后，HL和HL+I/R组的IL-1、TNF-α水平明显高于空白对照组，其中HL+I/R组的升高趋势要大于HL组和I/R组（p<0.05或p<0.01）。（2）I/R组大鼠肝线粒体SOD活性与空白对照组相比呈下降的趋势，Ca~(2+)水平呈上升趋势（p<0.05或p<0.01）；HL和HL+I/R组肝线粒体SOD活性和GSH-PX含量较空白对照组有明显的降低，MDA和Ca~(2+)水平显著增高，其中HL+I/R组的变化较单纯高脂血症和缺血再灌注组更为显著（p<0.05或p<0.01）；HL组和I/R组大鼠肝组织CYP2E1活性及表达与空白组比较明显增强（p<0.05或p<0.01），HL+I/R组大鼠肝组织CYP2E1的表达变化显著高于HL组和I/R组（p<0.05或p<0.01）。 4.细胞凋亡相关指标检测：（1）TUNEL法检测发现，空白对照组大鼠肝组织凋亡细胞数较少，I/R组偶见凋亡细胞，HL组和HL+I/R组的凋亡细胞都呈现不同程度的增加（p<0.05或p<0.01），其中HL+I/R组的凋亡细胞增加最为显著（p<0.05或p<0.01）；（2）免疫组化结果显示，与空白对照组比较，HL组和HL+I/R组中caspase-3表达水平明显增高，bcl-2的表达在这二者中则明显降低。Western blot的结果同样证明以上结论，caspase-3蛋白表达水平明显增高，bcl-2的蛋白表达则明显降低，HL+I/R组变化更加显著（p<0.05或p<0.01）。 结论: 在整体动物水平，证明了脑缺血再灌注能加重高脂血症引发的大鼠肝损伤,其机制与急性脑缺血再灌注增强CYP2E1诱导，进一步促进炎症反应、氧化应激及肝细胞凋亡过程有关。