猪β-防御素基因表达特点及维生素A的调节作用

防御素是抗菌肽家族成员之一,具有广泛的抗菌、抗病毒、抗寄生虫和免疫调节作用,是机体免疫系统的重要组成部分。维生素A作为一种免疫调节剂,对动物的抗感染能力、细胞因子以及相关基因表达水平的影响十分明显。然而,关于猪防御素基因表达规律及维生素A对其表达的调节作用目前尚未见报道。本研究旨在考察猪防御素基因表达的品种和组织差异及维生素A对其表达的影响,以揭示猪防御素基因的表达特点和维生素A的调节作用。本试验首先考察了不同抗病力的两种猪体内防御素-1、2、3基因表达的差异,并通过体外细胞培养试验比较了不同维生素对防御素-1、2、3基因表达的影响,重点研究了在动物试验中维生素A对猪防御素-1、2、3基因表达的影响,初步探讨了维生素A影响猪防御素-1、2、3基因表达的信号转导机制。本研究包括以下四个试验： 试验一DLY和梅山仔猪pBD基因表达差异的研究 通过观察防御素基因在DLY和梅山仔猪各个组织中的表达水平,比较了两个猪种之间的表达差异。本实验随机选择健康的7日龄梅山猪和DLY(杜×长×大)杂交猪各6头,公母各半。屠宰后立即取其小肠黏膜、心、肝、脾、肺、肾、脑、皮肤、肌肉、口腔黏膜、呼吸道上皮、舌头、胸腺、生殖道上皮、睾丸(公)或卵巢(母),提取总RNA,用Real-time PCR方法检测pBD-1、2、3基因mRNA表达水平。 结果表明：所有组织中均能检测出pBD基因mRNA的表达。其中梅山猪中,pBD-1、2、3在舌头和口腔黏膜的表达量最高；而DLY杂交猪中,pBD-1、3在舌头和口腔黏膜的表达量最高,pBD-2在肾脏和肝脏的表达量最高。绝大部分组织的pBD基因表达量均为梅山猪高于DLY杂交猪,其中小肠黏膜、舌、口腔黏膜和生殖道黏膜等与外界接触的组织中的pBD-1、2、3表达量均是以梅山猪为高。由此显示,猪pBD的表达存在明显的品种差异和组织特异性,梅山猪体内pBD-1、2、3基因在多个组织中的表达量要高于DLY三元杂交猪。 试验二VA、VD、VE对IPEC-J2细胞系pBD基因mRNA和蛋白质表达的影响 为了考察VA、VD、VE对pBD-1、2、3基因mRNA与蛋白质表达的影响,本实验选用猪小肠上皮细胞系IPEC-J2为研究对象,在无血清DMEM/F12培养基上分别添加不同浓度的维生素A、D、E培养,24小时后,提取总RNA和蛋白。用Real-timePCR法测定pBD-1、2、3基因mRNA表达水平,用ELISA方法测定pBD-1、2、3蛋白含量。分析不同浓度维生素对pBD基因与蛋白表达的影响。 结果表明：维生素A、D、E均能够不同程度的诱导猪小肠上皮细胞pBD基因的表达并能促进pBD蛋白的分泌。其中,0.5-20μmol/L维生素A可显著提高pBD-1、pBD-2和／或pBD-3基因的mRNA表达水平和蛋白质表达水平；5-50 nmol/L维生素D显著提高了pBD-1、pBD-2或pBD-3基因的mRNA表达水平或蛋白质表达水平；20和50μg/ml维生素E显著提高了pBD-1和pBD-3基因的mRNA表达水平或蛋白质表达水平。结果提示,在本实验浓度范围内,维生素A、D、E可以促进pBD-1、2、3基因mRNA与蛋白的表达,其中维生素A对pBD-1、2、3基因表达的促进作用效果较好。 试验三VA对DLY和荣昌仔猪pBD基因表达的影响 为了考察动物试验中维生素A对内源防御素表达的影响,本试验选用产期相近、胎次相似、相同环境饲养健康的21日龄断奶、体重约3.5-4 kg荣昌猪断奶仔猪24头,按体重随机分为4组,1、3组饲喂维生素A缺乏日粮,2、4组饲喂正常水平维生素A日粮。另外选择产期相近、胎次相似、相同环境饲养健康的21日龄断奶、体重6.5-7kgDLY断奶仔猪30头,按体重随机分为5组,5、7组饲喂维生素A缺乏日粮,6、8组饲喂正常水平维生素A日粮,9组饲喂高剂量维生素A(5倍NRC水平)日粮。每个处理组设有6个重复,每个重复1头猪,试验期包括预饲两周和正式试验四周,在正式试验第14天对3、4、7、8和9组实验动物接种PRRS弱毒苗。进行饲养试验和屠宰试验。 结果表明： 1.DLY猪的日增重和日采食量均显著高于荣昌猪；攻毒(接种PRRS弱毒苗)显著降低了两种猪的日增重和日采食量,显著升高了其料重比；攻毒对DLY猪生产性能的影响强于荣昌猪； 2.DLY猪体内血清视黄醇浓度和肝脏视黄醇浓度均显著高于荣昌猪；攻毒可降低猪血清视黄醇浓度,显著提高肝脏视黄醇浓度；维生素A缺乏显著降低了血清视黄醇浓度和肝脏视黄醇浓度；高剂量维生素A显著升高了肝脏视黄醇浓度,升高血清视黄醇浓度； 3.攻毒显著提高了猪血清中免疫球蛋白IgA、IgG、IgM的浓度；维生素A缺乏显著降低了猪血清中免疫球蛋白IgA、IgG、IgM的浓度；攻毒对DLY猪血清中IgA和IgG的影响强于荣昌猪； 4.攻毒显著提高细胞因子IL-1a、IL-1B、IL-10的浓度；维生素A水平缺乏显著提高了细胞因子IL-1a、IL-1β的浓度,降低了细胞因子IL-10的浓度； 5.接种PRRS弱毒苗对pBD-1、3基因表达的影响不大,能显著提高pBD-2在肺、脾、肠系膜淋巴结和腹股沟淋巴结中的表达；日粮中维生素A水平对pBD-2基因表达的影响不大,能显著影响pBD-1、3在舌、口腔黏膜、呼吸道黏膜和小肠黏膜中的表达。 结果显示,攻毒降低了试验动物日采食量、日增重和血清维生素A,提高了猪血清中免疫球蛋白IgA、IgG、IgM的浓度,提高了pBD-2基因在肺、脾、肠系膜淋巴结和腹股沟淋巴结中的表达,相比较而言,攻毒对DLY猪的影响要强于荣昌猪；维生素A缺乏降低了血清视黄醇的含量与体内部分组织中pBD-1、3基因的表达,攻毒可以加剧这种作用。试验四VA影响pBD基因表达信号转导机制的研究 为初步揭示维生素A诱导pBD-1、2、3基因表达的信号转导机制,本试验以IPEC-J2细胞系为研究模型,考察信号通路阻断剂对维生素A诱导pBD-1、2、3基因mRNA表达的影响。试验选用的信号通路阻断剂有NF-κB通路阻断剂MG-132和MEK-ERK通路阻断剂PD98059,采用单因子试验设计,共分对照组、维生素A组、MG-132组、PD98059组、维生素A+MG-132组和维生素A+PD98059组6个处理组。 结果表明,MG-132极显著的降低了维生素A对pBD-2基因的诱导作用,PD98059极显著的降低了维生素A对pBD-1和pBD-3基因的诱导作用。结果提示,NF-κB通路可能是维生素A影响pBD-2基因表达的信号转导通路之一；MEK-ERK通路可能是维生素A影响pBD-1、3基因的表达的信号通路之一。 综上所述,本研究结果表明： 1.抗病力不同的梅山猪和DLY猪体内pBD的表达水平也不相同,抗病力较高的地方猪种——梅山猪具有较高的防御素表达量。 2.维生素A、D、E均能够诱导猪小肠上皮细胞pBD-1、2、3基因的表达,并能促进其蛋白质的分泌。其中,维生素A对pBD-1、2、3基因表达的诱导作用最为显著。 3.在正常和攻毒两种状态下,日粮维生素A的含量对舌、口腔黏膜、呼吸道黏膜和小肠黏膜等组织中pBD-1、3基因的表达有显著影响,高水平维生素A日粮可以促进这些组织中的pBD基因的表达。 4.本试验初步证明,MEK-ERK通路是维生素A诱导pBD-1、3基因的表达的信号转导通路之一；NF-κB通路是维生素A诱导pBD-2基因表达的信号通路之一。