基于质谱的甲状腺乳头状癌蛋白质组学研究

甲状腺癌是常见的内分泌恶性肿瘤,其患病率逐年增加,其中乳头状癌占80%以上,已危害身体健康,增加了经济负担,是当今关注的热点问题。目前临床常用的诊断及辅助检查的方法有超声诊断检查、细针穿刺（FNA）细胞学检查、血清甲状腺素等。FNA细胞学检查是目前临床上区分甲状腺结节良恶性的最有效手段,但在临床中,约10%20%的FNA细胞学难以做出准确诊断。鉴别诊断和监测手段的常规化一直是临床上的一大难题。近年来,利用蛋白质组学技术,多种肿瘤早期诊断的研究取得了可喜的进展,发现了一系列肿瘤相关蛋白和潜在的肿瘤标记物并初步应用于临床。国内外已有甲状腺癌的蛋白质组学研究,发现了一些与甲状腺癌相关的蛋白,然而这些成果尚处于初级阶段,尚没有可以应用于临床诊断的理想的肿瘤标记物。大部分研究也未进行良恶性肿瘤的鉴别分析,而且国内外对甲状腺癌的蛋白质组学研究报道较少。基于甲状腺癌的现状,首先对我院近几年来甲状腺癌发病情况作以回顾性分析。从性别、年龄、淋巴结情况及病理类型构成比等方面进行比较分析。其次利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF MS）技术检测甲状腺乳头状癌患者、良性肿瘤和正常健康人血清中多肽,建立甲状腺乳头状癌的诊断预测模型,随后对差异血清多肽进行分离、鉴定及功能预测分析。最后,采用蛋白质谱成像原位分析甲状腺乳头癌蛋白质的表达,创建甲状腺乳头状癌的蛋白离子成像图。第一部分:甲状腺癌临床和病理学特点的回顾性分析回顾性分析2011年1月至2017年12月在济南军区总医院进行手术治疗的3567例甲状腺结节病患者临床病理资料。术后石蜡组织病理学显示:1392例患者为良性甲状腺肿瘤,2175例为甲状腺癌患者,其中2135例为甲状腺乳头状癌患者。应用SPSS19.0统计软件进行分析,统计结果以P<0.05作为差异具有显著性统计学意义为标准。结果发现:1、甲状腺良性肿瘤患者占所有甲状腺结节病患者的39.02%,结节性甲状腺肿和甲状腺腺瘤是甲状腺良性肿瘤的主要组成部分。2、甲状腺癌病例数逐年增加,其中以乳头状癌的增加为主。3、男女患者性别比为1:3.22;2011年至2017年,甲状腺癌患者性别比年间变化不大,年间比较无显著性差异（P>0.05）。男女高发年龄段均为30～59岁,男性平均年龄为44.83±11.91岁,女性平均年龄为45.69±10.98岁,男女发病的平均年龄相近（P>0.05）。4、微小乳头状癌占乳头状癌的比例逐年上升（P<0.05）。甲状腺癌总的淋巴结转移率为54.39%,年间变化无明显差异（P>0.05）。由此可以看出,甲状腺良性肿瘤占甲状腺疾病较大的比重,而结节性甲状腺肿和甲状腺腺瘤是甲状腺良性肿瘤的主要组成部分。甲状腺乳头状癌的患病数量逐年增加,且乳头状微小癌的比例逐年上升。甲状腺癌的性别构成比及发病年龄年间并无明显变化。虽然总的淋巴结转移率较高,但年间并无明显差异。第二部分甲状腺乳头状癌血清生物标志物的筛选通过第一部分及来自不同研究人员对甲状腺疾病的回顾性分析,我们发现甲状腺乳头状癌及良性结节性甲状腺肿是甲状腺疾病的主要病理类型。为了更好的鉴别诊断甲状腺乳头状癌,我们运用弱阳离子交换磁珠（MB-WCX）提取血清中的多肽/蛋白,MALID-TOF/TOF MS检测52例甲状腺乳头状癌（PTC）和48例非癌症对照（18例良性结节性甲状腺肿患者和30例健康查体者）血清多肽/蛋白图谱,应用ClinProTools3.0质谱软件中的快速算法（Quick Classifier,QC）建立PTC与非癌症对照的诊断预测模型。并用一个独立的验证组（36例PTC患者及19例良性结节性甲状腺肿患者和13例健康查体者）验证诊断预测模型的诊断能力。结果发现该诊断预测模型的识别能力（Recognition ability,RC）和交叉验证（cross validation,CV）分别为:90.95%和82.90%。通过独立样本的验证,该模型具有84.38%的敏感性和78.13%的特异性。同时发现PTC患者组与对照组之间存在差异多肽峰97个,其中6个多肽差异明显（P<0.05）,且ROC曲线下的面积不小于0.75;4个峰m/z 5905.22、2671.17、1464.68、1738.92在两组之间差异最大。因此基于MALDI-TOF MS技术建立的甲状腺乳头状癌的诊断预测模型具有较高的敏感性和特异性,能够较好的区分PTC患者和良性甲状腺结节患者及健康人群。6个具有较高诊断能力的多肽具有成为鉴别诊断PTC生物标志物的潜能。第三部分甲状腺乳头状癌血清生物标志物的鉴定为了进一步了解这些差异多肽的序列及相应蛋白质的性质、功能及在甲状腺乳头状癌发病机制中的作用,应用纳升液相电喷雾串联质谱（nano-LC/ESI-MS/MS）系统对4个差异最明显的多肽进行分离鉴定。首先取30个差异峰高表达的样本,运用MB-WCX富集多肽。收集富集的多肽液,运用nano-LC-MS/MS进行分离鉴定,数据分析软件BioworksBrowser3.3.1进行SequestTM(IPI Human（3.45）搜库。结果发现,峰位于m/z 2671.17和1464.68处的多肽质谱分析确定其氨基酸序列为“K.SYKMADEAGSEADHEGTHSTKRGHA.K”和“A.DSGEGDFLAEGGGVR.G”,通过搜库发现都为血纤维蛋白原a链（Fibrinogen alpha chain）上的肽段。峰m/z1738.92的氨基酸序列为“R.NGFKSHALQLNNRQI.R”,搜库发现为补体C4A/B的肽段;而峰在m/z 5905.22处的多肽未被鉴定出,但通过检索文献发现其也为纤维蛋白原a链上的一段肽段。因此,血纤维蛋白原a链和补体C4A/B上的肽段可能是潜在的甲状腺乳头状癌的特异性分子标志物而有望应用于血液学的检测。第四部分甲状腺乳头状癌组织MALDI质谱成像原位蛋白质表达分析在本研究中,我们通过MALDI-TOF/TOF质谱成像17例甲状腺乳头状癌组织、15例癌旁正常组织及5例腺瘤组织,获得不同组织的蛋白图谱,把MALDI MSI图谱输入到SCiLS Lab（2014b）软件（质谱成像分析软件）中,比较来自不同组织的平均谱图。Kruskal-Wallis检验癌组织和腺瘤组织与癌旁正常组织之间的蛋白峰。发现m/z9278.369,4945.61,6847.11和4614.838的蛋白分子在不同组织中呈现不同的表达且具有明显差异（P<0.001）。m/z 9278.369和4945.61蛋白分子富集于癌旁组织区域;m/z4614.838蛋白分子在腺瘤组织区最为丰富;而m/z6847.11蛋白分子特异地表达于癌组织区域。利用这4个差异蛋白进行质谱成像。从质谱成像图中可以看出,不同质荷比的蛋白分子在甲状腺组织中的分布明显不同。这项研究显示了MALDI MSI在分子水平上分析组织冷冻切片的临床应用。不同质荷比的蛋白质分子在甲状腺组织中分布的丰度及区域明显不同,那么这些在特定组织中差异表达的蛋白分子有望发展成为鉴别甲状腺乳头状癌、腺瘤与癌旁组织的潜在标志物。而且创建的不同蛋白离子的质谱成像图,可以发现肿瘤的边界,明确肿瘤的进展,为临床病理诊断提供理论依据和实践基础。同时可以建立组织病理与质谱成像相补充的系统诊断方法来解决临床病理诊断中的难题。