高脂饲料诱导大鼠肥胖形成及骨髓间质干细胞在体内的迁移分化

第一部分体外细胞的培养 【目的】探寻体外分离培养大鼠成熟脂肪细胞、前脂肪细胞的最佳方法。 【材料与方法】体外培养大鼠成熟脂肪细胞和前脂肪细胞,对脂肪细胞和前脂肪细胞的培养方法在以下几个方面做出改良:细胞加入培养板的方式、离心速度、消化酶的类别、添加物和消化时间。采用改良天花板培养法培养脂肪细胞时采用胶原酶I消化脂肪组织60～90分钟,将消化后的组织以250g的转速离心5分钟,反复离心、洗涤后,用含有20%新生牛血清的DMEM/F12脂肪细胞培养基重悬细胞,细胞移入6孔板中,待细胞牢固粘附后,再缓缓加入培养基进行培养。用酶消化法体外培养大鼠原代前脂肪细胞,将脂肪组织消化后以800g的转速离心5分钟,反复离心、洗涤细胞,将细胞移入培养瓶中培养,通过换液去除混杂的红细胞。对培养得到的原代前脂肪细胞进行传代、诱导其分化为脂肪细胞。通过显微镜观察及油红O染色结果,鉴定所培养的脂肪细胞、前脂肪细胞。 【结果】使用改良天花板培养法在体外培养出大鼠脂肪细胞,利用形态学观察和油红O染色进行鉴定,培养出的细胞形态均一、生长稳定、数量众多;对大鼠前脂肪细胞的培养方法进行改良后,培养出的前脂肪细胞可以在体外传代,诱导分化为脂肪细胞,经形态学观察和油红O染色证实,以此方法培养出的前脂肪细胞形态一致,增殖分化旺盛。 【结论】以改良后的方法在体外培养得到大鼠脂肪细胞和前脂肪细胞。获得的脂肪细胞形态均一、生长稳定、数量众多,前脂肪细胞成分均一,增殖旺盛,能够分化为成熟脂肪细胞,具有前脂肪细胞的典型特征。改良后的脂肪细胞和前脂肪细胞的培养方法均方便简单,结果稳定,易于推广。 第二部分高脂饲料诱导大鼠肥胖模型的建立 【目的】建立一种高脂饲料喂养诱导的大鼠肥胖模型,比较大鼠在高脂饲料喂养条件下体重增长的不同模式及血生化特点。 【材料与方法】采用40只刚断乳（28天）雄性SD大鼠,随机分为对照组（10只）和实验组（30只）,分别喂以100%普通饲料和75%高脂饲料+25%普通饲料的混合饲料12周,每周测定体重1次,喂养12周后处死大鼠,取股静脉血测定血清胰岛素、瘦素、血糖、总胆固醇（Total cholesterol,TC）、甘油三酯（triglyceride,TG）、高密度脂蛋白（High-density lipoprotein,HDL）和低密度脂蛋白（Low-density lipoprotein,LDL）水平,并称取附睾和肾周脂肪组织的重量。 【结果】实验开始后,普通饲料组和高脂饲料组的体重增长表现出不同的增长模式,高脂饲料喂养大鼠比正常饲料喂养大鼠的体重增加快。研究结束时,即12周后,高脂饲料喂养的大鼠体重和体重增加值分别是普通饲料喂养大鼠的119.8%和126.0%。按照处于体重增加上限的1/3作为饲料诱导肥胖（Diet-induced obesity, DIO）大鼠、下限的1/3作为饲料诱导抵抗（Diet-induced resist, DR）大鼠、其余大鼠作为不可分（non-categorizable, NC）大鼠的原则,同时考虑个别大鼠前11周大鼠体重情况,将30只高脂饲料喂养的大鼠中的12只确定为DIO大鼠、9只确定为DR大鼠、剩余9只确定NC大鼠。从实验的第2～3周开始,普通饲料喂养组、DIO大鼠和DR大鼠体重增长曲线逐渐分开直到研究结束,8周后,普通饲料喂养组、DIO和DR组大鼠的体重增加值、体重增长曲线完全分开的,即没有任何重叠。高脂饲料喂养大鼠与普通饲料喂养大鼠血清胰岛素、TC、HDL、LDL无显著性统计学差异,前者血清瘦素、血糖、TG水平显着升高,与普通饲料喂养组大鼠相比具有统计学意义（P<0.05）。此外,DIO、DR和NC三组大鼠间血清胰岛素、TC、HDL、LDL无显著性统计学差异,DIO大鼠瘦素、血糖水平比DR大鼠明显升高。高脂饲料喂养大鼠的脂肪垫重于普通饲料喂养大鼠,DIO大鼠肾周脂肪垫重于DR大鼠,其差异具有统计学意义,而附睾脂肪垫重量的差别则没有统计学意义 【结论】高脂饲料能诱导大鼠肥胖。与普通饲料喂养的大鼠相比,高脂饲料喂养大鼠体重增加多20%26%,高脂饲料喂养的前6～8周是肥胖发育的关键期。在高脂饲料喂养的条件下,可以观察到大鼠不同的体重增加模式,8周后高脂饲料喂养的大鼠可以分为饲料诱导肥胖大鼠和饲料诱导抵抗大鼠。高脂饲料喂养的大鼠血清瘦素、血糖和甘油三酯水平高于普通饲料喂养大鼠,饲料诱导肥胖大鼠瘦素、血糖水平比饲料诱导抵抗大鼠明显升高。 第三部分高脂饲料喂养条件下大鼠体内骨髓间质干细胞向脂肪组织的迁移分化 【目的】探讨高脂饲料喂养条件下,大鼠骨髓间质干细胞在体内向脂肪组织迁移分化的情况。 【材料与方法】将绿色荧光蛋白标记的间质干细胞按照1×106细胞/100g体重的剂量经尾静脉输入雄性刚断乳（28天）SD大鼠体内,给予含75%高脂饲料+25%普通饲料的混合饲料进行喂养。分别在移植绿色荧光蛋白标记的间质干细胞后7、8、9、10、11周处死大鼠,取大鼠多个部位的脂肪组织,制成石蜡切片,进行DAPI染色,通过激光共聚焦测定绿色荧光蛋白阳性的细胞、免疫组织化学和Western Blotting检测绿色荧光蛋白。 【结果】在大鼠肠系膜等处脂肪组织切片上,都可观察到同时表达绿色荧光和蓝色荧光的细胞,从细胞形态上观察其为脂肪细胞,这样的细胞散在分布,分布不均匀。与其他部位脂肪组织相比,肠系膜处脂肪组织中含有的同时表达绿色和蓝色荧光的细胞较多。免疫组化、Western Blotting检测方法均检测到组织中存在绿色荧光蛋白。 【结论】表明骨髓间质干细胞在高脂饲料喂养条件下在体内可以向脂肪组织迁移分化成为脂肪细胞