BMSCs联合骨髓移植建立嵌合体并诱导免疫耐受形成的机制研究

研究意义 异体器官移植已成为脏器功能衰竭治疗中的一种常规治疗方案。在器官移植领域，目前主要使用免疫抑制药物来避免、减轻和逆转排斥反应，但是使用这些药物的同时也带来了一系列问题，如感染几率增加、恶性肿瘤发病率提高、费用昂贵等。尽管如此，这些方法仍不能避免慢性移植物功能衰竭，因此，大量研究致力于寻求一种更好的方法建立免疫耐受。经骨髓移植建立混合嵌合体被证实是建立异体移植免疫耐受的理想方法之一。然而，在诱导混合嵌合体的过程中，受体必须经过辐射、放疗及化疗等预处理方案，以提高造血干细胞移植成活率，这点很大程度上限制了该技术的推广应用。到目前为止，仍没有一种切实可靠、适用于临床的预处理方案。 BMSC在体外易于培养扩增，BMSCs的低免疫原性与免疫调节两方面特性使得它在治疗移植排斥方面具有潜在优势。目前，人们已经利用BMSCs的免疫调节特性对自身免疫性疾病、全身炎症反应综合症及GVHD等多种疾病展开治疗，并取得良好的效果。基于目前通过骨髓移植建立嵌合体尚无低毒性预处理方案，本研究拟尝试用BMSCs对受体进行预处理，然后进行骨髓移植，观察是否可以成功建立混合嵌合体并形成免疫耐受。基于Th17/Treg细胞在免疫排斥与耐受中的重要地位，本研究进一步通过体外实验研究BMSCs对Th17/Treg细胞分化的影响，并对其机制进行探索。 材料与方法 1.将供体（Balb/c）小鼠来源BMSCs进行体外培养扩展，通过尾静脉向受体输注，然后将供体骨髓向受体移植，观察在不使用免疫毒性药物的情况下是否可以移植成活形成嵌合体；在此基础上，将供体及第三方（ICR）小鼠来源皮片向受体移植，观察其存活情况，分析是否形成免疫耐受； 2.体外培养受体CD4+T细胞作为反应细胞，获取供体脾细胞为刺激细胞，二者进行单向混合淋巴细胞反应，观察在异体抗原刺激下初始T细胞向Th17/Treg细胞分化情况；进一步在该体系中加入BMSCs进行混合培养，观察BMSCs对Th17/Treg细胞分化的影响，通过对细胞因子等进行检测，初步探讨其可能机制； 3.通过1-D-MT抑制BMSCs细胞内IDO功能，观察BMSCs对Th17/Treg细胞分化的影响，分析IDO在BMSCs干预Th17/Treg细胞分化中的作用。 结果 1.BMSCs对受体预处理后进行骨髓移植，受体外周血中可持续检测到供体来源细胞，在移植4周后，供体细胞占外周血总细胞约20-25%；在该模型上进行皮肤移植，发现供体来源皮肤可长期存活，值得关注的是，供体来源皮肤的毛发在移植后可持续正常生长，提示未发生移植物慢性功能丧失。病理切片显示，供体来源皮片结构完整，仅有少量单个核细胞浸润，而第三方来源皮片则出现表皮脱落，基底层大量单个核细胞浸润等；通过取脾细胞进行单项混合淋巴细胞反应，发现成功建立嵌合体的小鼠脾细胞对于供体抗原具有低反应性，而对第三方抗原反应性正常； 2.通过单项混合淋巴细胞反应结果发现，异体抗原刺激初始T细胞，可促使其向Th17/Treg细胞分化；BMSCs干预后，反应性T细胞增殖明显受抑制，同时Th17细胞比例减少，而Treg细胞增多，进一步分析发现，BMSCs可降低反应体系中IL-1β、IL-2、IL-6及IL-17，同时提高IL-10、TGFβ1及IDO； 3.通过1-D-MT预孵育可抑制BMSCs细胞内IDO功能，该BMSCs对T细胞增殖及Th17/Treg细胞分化的影响作用明显降低，但培养体系内介导TGFβ1及IL-6水平与正常BMSCs组比较未见明显差异。 结论 在不使用任何免疫毒性药物的情况下，通过BMSCs联合骨髓移植可成功建立混合嵌合体并形成供体特异性免疫耐受，在此模型上进行供体皮肤移植可长期存活；BMSCs可促使异体抗原刺激引起的Th17/Treg细胞分化向Treg细胞方向偏移，IDO在其中可能具有关键性作用。