具有PPARα/γ双重激动作用的抗糖尿病药物的生物学筛选

肥胖及其所诱发的2型糖尿病已成为危害人类的重要疾病。许多资料表明，肥胖与2型糖尿病共同存在，并且关系十分复杂。2型糖尿病中超过85％的人表现为肥胖，同时肥胖又是诱导2型糖尿病发生的重要危险因素。肥胖患者常常伴随着脂代谢紊乱，这将导致机体对胰岛素敏感性的降低，最终可诱发2型糖尿病的发生。同时2型糖尿病患者也伴随高血脂血症。因此，调节脂代谢紊乱、改善胰岛素抵抗是预防和治疗2型糖尿病的新方向。 过氧化物增生活性受体（PPARs）是配体激活转录因子，属于核受体超家族成员。它可以同时调控多种基因表达，参与了葡萄糖和脂代谢调节等重要的生理过程。不同的PPAR亚型有不同的组织分布和生理功能。PPARa主要分布在肝脏组织中，其主要作用是调节脂代谢。PPARγ主要分布在脂肪组织和骨骼肌中，其主要作用是增加组织对胰岛素的敏感性，调节葡萄糖的代谢。因此，以PPARs为药物靶标，发现和优化PPARa／γ双重激动剂将为肥胖和2型糖尿病的预防和治疗提供有效的药物。 本文通过体内和体外多种筛选平台，对新合成的85个化合物进行PPARa和PPARγ双重激动作用的筛选。并在PPAR转录调控水平，对所筛选出化合物的降糖降脂机制进行了初步探讨。 首先，应用PCR和DNA的克隆技术构建了pM-hPPARa、pM-hPPARγ和pB4-RES-tk-luc质粒，组成了萤火虫荧光素酶单报告基因的筛选平台。并运用瞬时转染的方法，将pM-hPPARa或pM-hPPARγ和pB4-RFS-tk-luc质粒转染到HEK-293细胞中，通过检测荧光素酶的活力，对85个新化合物进行PPARa和PPARγ双重激动作用的初步筛选。结果表明，18个化合物有较好的PPARa／γ的双重激动作用。 然后，基于PPARa功能的降脂作用和基于PPARγ功能的促前脂肪细胞分化作用，在功能水平对18个化合物的PPARa／γ双重激动作用进行了第二次筛选。结果表明，有10个化合物能够明显的降低急性高脂小鼠的血脂水平，同时能够促进前脂肪（3T3-L1）细胞分化并有较好的量效关系。通过萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶所组成的双报告基因筛选平台，评价了10个化合物对PPARa和PPARγ激动作用的EC50．结果表明有7个化合物具有较强的PPARa／γ双重激动作用，它们对PPARa的激动作用强于罗格列酮（阳性对照药物），对PPARγ的激动作用相当于罗格列酮。 通过人正常胚肺细胞（HLF）细胞生长抑制试验、大鼠胚胎中脑微团致畸试验和小鼠的急性毒性试验，对7个化合物的体内外毒性进行初步评价，结果表明，有1个化合物有较强的细胞毒性和潜在的致畸作用，其它6个化合物的体内和体外毒性较小。 为了明确化合物的降糖降脂效果，通过正常小鼠的糖耐量试验以及2型糖尿病小鼠模型的降糖降脂试验，对化合物进行了整体动物的药效水平筛选。在糖耐量试验中，化合物对正常小鼠的血糖和糖耐量没有影响，表明化合物的作用靶点不是胰岛B细胞。在2型糖尿病小鼠的降糖降脂试验中，化合物10mg／kg剂量时，能够明显降低血中的葡萄糖、游离脂肪酸（FFA）、甘油三脂（TG）和总胆固醇（T-CHO）的浓度，升高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的水平。同时化合物在3mg／kg剂量时，也表现出对葡萄糖、TG和FFA较好的调控作用，表明化合物在高剂量时对2型糖尿病有较好的治疗作用。在低剂量时，化合物能够通过改善脂代谢紊乱，达到预防胰岛素抵抗及2型糖尿病的作用。 最后，通过RT-PCR和western印迹法对PPARa和PPARγ的组织分布进行研究。结果表明，PPARa主要表达在人的肝脏细胞和小鼠的肝脏组织中，而PPARγ在人的肝脏细胞、小鼠的脂肪细胞和骨骼肌细胞以及肝脏组织、脂肪组织和骨骼肌中均有表达。RT-PCR进一步研究表明，化合物能够通过激活PPARa和PPARγ，增加肝脏组织中脂蛋白酯酶（LPL）、乙酰辅酶A氧化酶（ACO）；脂肪组织中特异的脂肪酸转运蛋白（aP2）、葡萄糖转运体4（GluT4）和LPL以及骨骼肌中GluT4的基因表达，表明化合物能够通过调节糖脂代谢的相关基因达到降糖调脂作用。 总之，我们通过体内外的多种筛选方法，筛选出6个具有PPARa／γ双重激动作用的化合物。这些化合物不仅能够调节糖脂代谢，而且可以促进前脂肪细胞的分化，改善胰岛素抵抗。结果表明，这些化合物有希望成为肥胖、高血脂症和2型糖尿病的新的预防和治疗药物。