基于血清药物化学和多组学的金银花与山银花的成分差异性分析研究

金银花(Lonicera japonica Thunb.)又名忍冬,为忍冬科植物忍冬属植物干燥花蕾或初开的花;山银花(Lonicera flos)则包括华南忍冬、红腺忍冬、灰毡毛忍冬及黄褐毛忍冬等,初开花的花蕾可入药。金银花和山银花都是药食两用的传统中药材,具有清热解毒、疏散风热的功效,在药品、食品、化妆品及保健品等行业被广泛应用。金银花与山银花属于“一药多基原”,因植物种属来源一致、药材外观和形态差别微小、药典记载的性味归经和功能主治也无明显差异,致使金银花与山银花在临床应用及推广中存在混用现象,为明确金银花和山银花的物质基础及药效差异,开展了如下相关研究。本研究以金银花(忍冬)和山银花(黄褐毛忍冬)为对象,利用UPLC/Q-TOF-MS分析技术,对金银花和山银花提取物及其血清移行成分进行分析鉴定;建立脂多糖(LPS)诱导的大鼠急性肺损伤(ALI)的疾病模型,并对大鼠予以金银花和山银花水提物预先灌胃处理,利用转录组和微生物组分析技术对ALI大鼠进行分析,以揭示金银花和山银花对急性肺损伤的保护差异及其可能作用机制。主要研究结果如下:1.金银花和山银花的化学成分分析研究建立忍冬和黄褐毛忍冬体外成分分析方法,对忍冬和黄褐毛忍冬提取物进行检测和分析鉴定;在忍冬水提物中共鉴定出46个化学成分,在黄褐毛忍冬水提物中共鉴定出57个化学成分,主要为黄酮、有机酸、生物碱、环烯醚萜、皂苷等类型的化合物。本次研究中,在黄褐毛忍冬中检测到大量的糖苷类化合物和环烯醚萜衍生物,通过检测鉴定分析,其数量多于忍冬,对于黄褐毛忍冬的后续成分鉴定和药理研究有重要意义。2.金银花和山银花的血清移行成分分析研究在血清药物化学的指导下,对大鼠口服忍冬和黄褐毛忍冬水提液后的血清进行成分分析,在大鼠口服忍冬提取物的含药血清样品中检测到15个移行成分,共鉴定出其中6个原型成分和6个可能的代谢产物;在大鼠口服黄褐毛忍冬提取物的含药血清样品中检测到15个血中移行成分,共鉴定定出其中12个原型成分和1个代谢产物忍冬和黄褐毛忍冬入血后的共有成分为绿原酸类化合物,经比对峰面积,发现其含量有所差异,这可能是两者用于临床药物治疗的差异体现。此外,在黄褐毛忍冬血清样品中也检测到川续断皂苷乙,与体外成分一致,而此物质未在忍冬体外和体内检测到,说明此成分是黄褐毛忍冬的特征性药物成分之一,也可能是忍冬和黄褐毛忍冬用于临床治疗的区别之一。3.转录组分析金银花和山银花对ALI大鼠的影响经病理学检测,忍冬组和黄褐毛组大鼠较模型组肺损伤程度轻微;ELISA测定结果显示,与模型组相比,忍冬组和黄褐毛组均显著降低了ALI大鼠血清和BALF的IL-1β、IL-6、TNF-α及肺组织的MDA、MPO的含量,肺组织中GSH-Px、SOD的浓度显著高于模型组;经过测序质量控制,共得到133.68 Gb Clean Data,各样品Q30碱基百分比均不小于94.05%。初步筛选出具有表达差异的基因:忍冬组和模型组DEGs 919个,黄褐毛组和模型组DEGs 504个,忍冬组和黄褐毛组DEGs 800个,其中476个表达上调,324个表达下调。通过Kobas 3.0软件分析DEGs中的KEGG途径,主要参与炎症,癌症,免疫系统、肠道疾病等相关的通路。肺组织RT-q PCR验证结果与RNA-seq表达模式一致,金银花通过下调THBS1,IL-1R1,IL-6R和CXCL1,上调CCDN1和KITA的m RNA表达;山银花通过下调TNFAIP3,IL-1R1,IL-6R,CXCL1和NFKBIA,上调CCDN1和KITA的m RNA表达,从而减轻ALI大鼠的肺部炎症反应。4.微生物组学分析金银花和山银花对ALI大鼠的影响通过微生物多样性分析,与空白大鼠相比,ALI大鼠的肠道菌群出现失调。乳杆菌属、毛螺菌科NK4A136群、未培养细菌Muribaculaceae、未培养细菌毛螺科菌、埃希氏菌—志贺氏菌属等菌属与ALI的发生和发展具有较高的关联忍冬和黄褐毛忍冬可能通过增加阿克曼菌属Akkermansia,拟杆菌Bacteroides和双歧杆菌Bifidobacterium等益生菌对肠道菌群产生影响,从而调节炎症因子水平,使得ALI得以改善。综上,金银花和山银花的化学成分有着明显的差异,但酚酸类成分是其共同的主要成分;入血后金银花和山银花的移行成分有着明显区别,为金银花和山银花药效研究提供数据支撑;通过LPS所致ALI大鼠的研究中,金银花和山银花通过调节炎症反应和修复肠道菌群对ALI大鼠减轻其肺部炎症反应,其机制可能与调控TNF和NF-κB信号通路及增加肠道内益生菌和降低有害菌丰度有关。本研究旨在从基础研究数据中说明金银花和山银花基原差异引起的药效物质基础及功效差异,从而为其临床应用及推广提供指导。