众所周知,冬虫夏草是一种名贵的中药,但是由于过度的开采,资源已近匮乏,所以近年来人们积极寻找冬虫夏草的替代品,降低对冬虫夏草的依赖。九州虫草,是目前唯一发现的以豆天蛾幼虫为寄主的虫草,目前已经实现人工培养。研究发现,虫草多糖是一种主要的活性成分,具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化等多种药理活性。但是,目前对九州虫草多糖的报道还很少,因此,本文从九州虫草的子实体中分级醇沉相应的多糖,纯化并对多糖的理化性质、抗氧化活性及免疫调节活性进行了研究。
以九州虫草子实体为研究材料,利用水提醇沉法提取多糖,获得30-50%醇沉区段两种粗多糖,分别记为CK-1、CK-2。实验中对CK-2进行了继续的纯化,经DEAE-纤维素DE-23离子交换柱层析,洗脱液为0.06M、0.1M、0.16M、0.32M的氯化钠溶液,得到的每个洗脱峰再经葡聚糖G-150凝胶柱纯化,共得到四种组分,分别命名为CK-2A、CK-2B、CK-2C和CK-2D。用高效凝胶柱层析法(HPLC)对其进行了纯度鉴定,结果表明纯化到的四种多糖组分都为均一组分。
对多糖CK-2A、CK-2B、CK-2C和CK-2D进行了理化性质的分析。结果发现,四种多糖的总糖含量分别为24.35%、17.33%、24.29%、18.22%,糖醛酸含量小于1.5%,蛋白质含量最高的是CK-2D,为4.341%,其余三种都很低。四种多糖的分子量分别为7153KDa、5945KDa、5643KDa、5642KDa。紫外光谱扫描显示,在200nm处有强吸收峰,在280nm处有小的蛋白吸收峰,说明多糖中含有少量的蛋白质；红外光谱分析结果为在2800-3000cm-1区域内出现有糖类的特征吸收峰,950-1200cm-1之间有吡喃糖环的特征吸收峰出现,表明多糖为吡喃糖。多糖经三氟乙酸水解,PMP衍生,HPLC检测发现,CK-2A的单糖组成为Fru:Man:Glu:Gal=1:0.92:1.09:0.72, CK-2B为Fru:Man:Gal=l:0.63:0.61, CK-2C的组成为Fru:Man:Gal=1:1.65:1.4, CK-2D为Fruc:Man:Gal=1:2.06:1.97。
最后,对多糖组分CK-2A、CK-2B、CK-2C和CK-2D进行了免疫调节活性和抗氧化活性的测定。CK-2A中未检测到内毒素的存在,CK-2B、CK-2C和CK-2D均含有微量的内毒素(低于0.5μg/ml LPS当量),进一步实验表明该内毒素含量没有明显的免疫调节活性。体外将不同浓度(125μg/ml、250μg/ml、1000μg/ml)的多糖与正常小鼠的脾脏淋巴细胞共培养,CCK-8细胞增殖与活性检测试剂盒检测发现,与空白对照相比,除了CK-2B的500μg/ml、1000μg/ml外,其余的浓度均能显著地促进淋巴细胞的增殖(P<0.01)。体内检测多糖对淋巴细胞增殖的结果为：四种多糖不仅能显著刺激正常小鼠混合淋巴细胞的增殖,而且对ConA/LPS诱导的T/B淋巴细胞的增殖也有显著的促进作用(P<0.01)；同时还使血清中TNF-a、IL-2的含量增加。四种多糖还能不同程度地增强正常小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力。但是,在体外多糖不能抑制黑色素瘤细胞B16的增殖。结果显示,九州虫草多糖对小鼠的免疫系统有一定的调节作用,推测多糖通过免疫调节作用发挥抗肿瘤的活性,而不是直接杀死肿瘤细胞。体外抗氧化实验发现,四种多糖在浓度为1-5mg/ml时都能不同程度地清除DPPH自由基,1mg/ml时,CK-2D的清除率最大,为35.6%;5mg/ml时,CK-2C的清除率最大,达到63.4%；CK-2A和CK-2B对DPPH自由基的清除能力较小。CK-2A和CK-2B对羟基自由基诱导的DNA损伤有一定的保护作用,CK-2C没有保护,CK-2D对DNA损伤的保护作用不明显,推测是相应多糖能部分的清除羟基自由基,从而减小质粒DNA的损伤程度。
