肺炎支原体感染对人肺上皮细胞蛋白表达的影响

【目的】肺炎支原体(MP)是目前所知能在无生命培养基中生长、繁殖的最小原核生物，基因结构十分简单，丧失了编码细胞壁及一些维持生存所必须的基因。这些特征决定了MP特有的寄生方式。 MP是一种人类致病原，能引起成人、儿童的社区获得性呼吸系统感染，是目前支气管炎、肺炎的重要病原之一。MP不但引起呼吸系统感染，而且尚与哮喘的发病密切相关，并可引起广泛多系统、多器官的肺外并发症。 但到目前为止，MP感染的发病机制仍不十分清楚，主要倾向于呼吸道上皮细胞吸附、免疫学发病机制和MP直接侵入学说。 近来细胞因子在MP感染中的作用日益受到重视。现已经在MP感染后的支气管肺泡灌洗液(BAL)、血、肺内检测到IL-2、4、5、6、10、12、18及INF等升高，并有研究表明MP感染人肺上皮细胞(A549)可诱导细胞内蛋白的变化与细胞因子的分泌，如IL-1，8，TNF等。其中IL-2，6，8，10，18等与MP所致疾病的严重性相关，IL-4，5可能参与MP引起的过敏性疾病，而MP有可能通过TGF-β1促进胶原蛋白的沉积进而共同参与气道重塑。 尽管MP吸附于呼吸道上皮细胞并与上皮细胞相互作用是感染早期发病机制中关键的一个环节，但目前对呼吸道上皮细胞被MP感染后所发生的反应知之甚少，且目前的研究都是基于对单一已知蛋白质进行的分析与鉴定，缺乏整体性与系统性，也无法对未知蛋白质进行分析，因而阻碍了这方面研究的深入。 随着后基因组时代的到来，蛋白质组学成为后基因组时代生命科学研究的热点领域。它是以蛋白质组为研究对象，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的活动规律。而2DE技术与MALDI-TOF-MS技术是蛋白组学研究中最经典的方法，目前已被广泛的应用于疾病发病机制的研究。 本研究首次应用蛋白组学技术从整体角度研究呼吸道上皮细胞受MP感染后细胞内蛋白质的变化，比较正常状态与受MP感染后A549细胞蛋白表达的差异，进一步了解呼吸道上皮细胞在MP感染中的作用、并为阐明MP感染的发病机制提供重要的理论依据。 【方法】本研究采用体外实验的方法。选用A549细胞和MP菌株，确定MP的合适浓度。我们用10～7Mp感染10～6A549细胞，12小时后收集细胞并提取胞内蛋白质，同时设立不加MP的对照组。对所提蛋白进行Bradford法定量后采用17cm，PH4-7的IPG胶条进行第一向等电聚焦，12.5％的SDS-PAGE进行第二向电泳分离，电泳后的凝胶用银染进行染色，并用PDQUest软件对电泳结果进行数据采集和图像分析，建立MP处理组和对照组的胞内蛋白质差异表达图谱。在此基础上，我们切取差异表达的蛋白质斑点，然后用特异性的胰酶消化蛋白质，酶解后的肽段采用Voyager-DE STR MALDI-TOF(ABI)质谱仪进行质谱分析。利用质谱分析得到的原始数据，通过MSCOT搜索NCBInr的蛋白质序列数据库进行初步的鉴定。 【结果】相差显微镜下未发现MP处理组和对照组细胞有明显的形态学改变，在双向电泳图谱分析中，空白对照组平均检测到968个蛋白点，处理组为976个蛋白点。通过PDQUest软件分析，MP处理A549细胞12小时后A549细胞内未检测到新的或消失的蛋白点，但发现有二十六个蛋白点与对照组比较在量上显著增加，而有三个蛋白点明显降低。利用MALDI-TOF-MS技术和生物信息学，我们初步鉴定了11个在MP处理组中升高的蛋白点，它们为细胞质骨架蛋白波形蛋白、葡萄糖-6磷酸脱氢酶等。 【结论】 1，MP感染可影响细胞内蛋白表达； 2，蛋白组学方法可以用于病原体发病机制的研究。