彩叶草（Solenostemon scutellarioides）叶色形成相关的花色素苷生物合成途径的分子调控研究

彩叶草（Solenostemon scutellarioides）是唇形花科（Lamiaceae）鞘蕊花属（Solenostemon）的多年生草本植物，具有丰富多彩的独特叶色，是一种重要的观叶植物，在园林绿化中广泛应用，备受关注。目前人们对彩叶植物叶色形成的分子机理的研究相当缺乏，对彩叶草不同品种间颜色差异的分子机制也不清楚，没有彩叶草叶色形成相关基因的克隆和表达调控的相关报道。这极大的限制了以彩叶草为代表的彩叶植物的分子育种和叶色基因工程的开展。由于花色素苷对彩叶植物叶色多彩的形成起主要作用，因此本论文对彩叶草花色素苷生物合成途径的分子调控进行了研究，从彩叶草红色品种（C4）叶片中克隆了控制花色素苷生物合成的四个关键酶基因，和两个可能参与苯丙氨酸不同支路调控的MYB R2R3转录调控因子，采用生物信息学分析、分子杂交、RT-PCR表达分析和在烟草中转基因表达等方法系统分析了它们的分子特征、表达特性和功能活性等。主要结果如下： 1、彩叶草查尔酮合成酶基因（SsCHS）的克隆及其在烟草中的表达 查尔酮合成酶是整个类黄酮和花色素苷合成途径的第一个关键酶。采用RACE方法，从彩叶草中首次克隆了查尔酮合成酶基因SsCHS的全长cDNA序列和对应基因组序列（Genbank登录号分别为EF522149和EF522150）。SsCHS基因由两个外显子和一个内含子组成，具有CHS基因的典型结构特征。NCBI blast及Vector NT I Suite 10.0分析表明，SsSHS基因编码蛋白序列与许多已知的植物CHS蛋白具有很高的相似性，尤其与同为唇形花科的紫苏的2个CHS蛋白的同源性最高。对SsCHS基因编码蛋白的高级结构的预测分析，发现推测SsCHS蛋白和结构与功能均己知的紫花苜蓿MsCHS2蛋白具有完全相同的必需活性位点和几乎完全相同的高级结构。Southern分析表明，SsCHS基因在彩叶草中可能含有5-8个拷贝，属于多基因家族。 半定量RT-PCR分析表明，在红色品种中SsCHS基因在茎、叶和花中表达，并且在叶中表达水平均较高，而在根中未检测到表达。白光诱导和干旱胁迫条件下，SsCHS基因在红色品种的叶中均表达上调。 构建了SsCHS基因的正义、反义和RNAi植物表达载体，并分别对烟草W38进行了转化，对正义转基因烟草做了进一步分析。在检测的45个转基因单株中，有近71％的类黄酮有显著提高，最高可达对照的3倍，表明超量表达SsCHS基因能够促进总黄酮的合成。然而也观察到约有11％的类黄酮显著下降，这可能是外源SsCHS基因与烟草内源的CHS基因发生共抑制（cosupresssion）所致。对SsCHS表达促进黄酮积累的32个株系的叶片花色素苷相对含量的检测表明，有22个株系得到显著提高，但也有6个株系变化不明显和4个株系显著下降，说明在转基因烟草的叶片中存在其它因素调控黄酮不同支路产物的分配。 2、彩叶草黄烷酮3-羟化酶基因家族（SsF3H）的克隆及表达分析 黄烷酮3-羟化酶是类黄酮和花色素苷生物合成途径的第三个关键酶，处于整个类黄酮和花色素苷生物合成途径的中枢位置。采用RACE方法，从彩叶草中克隆了SsF3H基因家族的两个成员的全长cDNA序列和对应基因组序列（SsF3H1 Genbank登录号分别为EF522151和EF522152；SsF3H2 Genbank登录号分别为EF522153和EF522154）。两个SsF3H基因都分别含有2个内含子，符合标准的GT-AG剪接方式。SsF3H1基因组全长1454bp，全长cDNA为1101bp（不含polyA），含有一个1092bp的ORF，编码一个363个aa的蛋白；SsF3H2基因组全长1495bp，全长cDNA为1175bp（不含polyA），含有一个1095bp的ORF，编码一个364个aa的蛋白。NCBI blastn和blastp表明，两个SsF3H基因的核酸及蛋白序列与已知的F3H基因核酸及蛋白序列有高度的同源性，尤其与紫苏F3H基因最相似。NCBI保守域搜索表明，SsF3H1和SsF3H2都含有保守的2OG-FeIIOxy结构域和PcbC结构域，具有结合亚铁离子的保守氨基酸H、D和H，以及结合酮戊二酸的RXS基序，与已知其它F3H蛋白一致，属于依赖于2-酮戊二酸的双加氧酶家族（2-ODD，2-oxoglutarate dependent dioxygenase），其反应都要依赖Fe2+、氧、2-酮戊二酸等作为辅因子。其编码的蛋白的高级结构预测表明，它们与已知功能的其它F3H蛋白和2-ODD酶具有十分相似的高级结构。Southern分析表明，SsF3H基因在彩叶草中可能含有2-3个拷贝。 半定量RT-PCR分析表明，SsF3H基因在红色品种的茎、叶和花中都有的总体表达，在根中都没有检测到表达，SsF3H基因的总体表达与各成员的表达情况基本一致。在红色叶中，SsF3H基因在白光诱导和干旱胁迫条件下，都总体表达上调。 构建了SsF3H2基因的正义和反义植物表达载体，分别对烟草W38进行了转化，初步得到转正义SsF3H2基因的76个Km抗性单株和转反义SsF3H2基因的64个Km抗性单株。 3、彩叶草二氢黄酮醇4-还原酶基因（SsDFR）的克隆及其在烟草中的表达 二氢黄酮醇4-还原酶是花色素苷生物合成途径中后期表达的第一个关键酶。采用RACE方法，从彩叶草中克隆了首个二氢黄酮醇4-还原酶基因SsDFR的全长cDNA序列和对应基因组序列（Genbank登录号分别为EF522155和EF522156）。SsDFR基因组全长1792bp，含有5个内含子，所有内含子符合标准的GT-AG剪接方式。其全长cDNA为1322bp（不含polyA），含有一个1101bp的ORF，编码一个366个aa的蛋白。NCBI的blastn和blastp表明，SsDFR基因的核酸及蛋白序列与已知的DFR基因核酸及蛋白序列有高度的同源性，尤其与紫苏DFR基因最相似。NCBI保守结构域搜索表明，SsDFR基因编码蛋白含有典型的3BetaHSD（3-beta hydroxysteroid dehydrogenase／isomerase family）结构域，属于3-β-羟基类固醇脱氢酶超家族（superfamily）。SsDFR中含有高度保守的与NADPH结合的保守基序（V10-Y33）和26个氨基酸组成的底物特异结合的保守基序（T134-K159），与其它DFR蛋白的保守结构一致。其编码的蛋白的高级结构预测表明，与已知结构和功能的葡萄VvDFR蛋白的活性位点和高级结构几乎相同。Southern分析表明，SsDFR基因在彩叶草中可能只有2个拷贝。 半定量RT-PCR分析表明，SsDFR基因在红色品种的茎、叶和花中均有较强表达，并且在叶中表达水平相对较高，而在根中未检测到表达。在红色品种的叶中，白光诱导和干旱胁迫都能诱导SsDFR基因表达上调。 构建了SsDFR基因的正义和反义植物表达载体，并分别对烟草W38进行了转化，对正义转基因烟草做了分析。在检测的35株超量表达SsDFR基因的转基因烟草中，叶片总黄酮含量都有不同程度的提高，增量为0.019％到49.78％之间，其中有28株显著增加（P＜0.01或0.05）。进一步对转基因烟草叶片的花色素苷相对含量的检测表明，所有转基因株系花色素苷相对含量都得到提高，增幅为2.88％到282.81％，其中有27个株系的含量显著高于对照（P＜0.01或0.05），表明SsDFR基因的超量表达能够显著提高叶片的花色素苷的含量。 4、彩叶草花色素合成酶基因家族（SsANS）的克隆及其在烟草中的表达 花色素合成酶是花色素苷生物合成途径中后期表达的第二个关键酶。采用RACE方法，从彩叶草中首次克隆了花色素合成酶基因家族（SsANS）的2个成员的全长cDNA序列和对应基因组序列（SsANS1 Genbank登录号分别为EF522157和EF5221528；SsANS2 Genbank登录号分别为EF522159和EF522160）。两个SsANS基因各含有1个内含子，符合标准的GT-AG剪接方式。SsANS1基因组全长为1655bp，cDNA全长为1184bp（不含polyA）；SsANS2基因组全长为1627bp，cDNA全长为1193bp（不含polyA）。它们均含有一个1101bp的ORF，均编码一个366个aa的蛋白。NCBI的blastn和blastp多序列比对显示，SsANS1和SsANS2基因核酸序列与编码蛋白质序列与已知的ANS基因的核酸与蛋白序列具有很高的相似性，与同为唇形花科的紫苏PfANS蛋白的同源性最高。两个基因编码蛋白都含有保守的2OG-FeIIOxy结构域和PcbC结构域，都具有结合亚铁离子的保守氨基酸H、D和H，和结合酮戊二酸的RXS基序，与其它已知ANS蛋白一致，与F3H蛋白均属于2-ODD酶家族，其反应也都依赖Fe2+、氧、2-酮戊二酸等作为辅因子。SsANS1和SsANS2蛋白的高级结构预测分析表明，它们与已知结构和功能的拟南芥AtANS蛋白的高级结构非常相似。Southern分析表明，SsANS基因在彩叶草中有2个拷贝，与分离的两个ANS基因相对应。 半定量RT-PCR分析表明，SsANS基因在红色品种的茎、叶和花中都有强的总体表达，在根中没有检测到表达，各成员表达情况与总体表达相似，其中SsANS1在叶中表达较强，而SsANS2在花中表达较强。在红色品种叶中，白光诱导和干旱胁迫，都能使SsANS基因总体表达上调。在白光诱导和干旱胁迫条件下，彩叶草的SsCHS、SsF3H、SsDFR和SsANS转活性都被增强，暗示它们可能具有协同表达的特征。 构建了SsANS1基因的正义和反义植物表达载体，并分别对烟草W38进行了转化，对正义转基因烟草做了分析。在检测的22株转基因烟草中，不同转基因株系的叶片总黄酮含量都有不同程度的提高，增量为0.12％到48.25％之间，其中有13株显著增加（P＜0.01或0.05），与超量表达DFR基因的转基因烟草的总黄酮增量相当。进一步对转基因烟草叶片的花色素苷的检测表明，所有转基因株系花色素苷相对含量都得到不同程度的提高，增幅为2.88％到246.58％，其中有18个株系的含量显著高于对照(（P＜0.01或0.05）。花色素苷相对含量增幅与转SsDFR基因的烟草相近，表明SsANS1基因的超量表达能够显著提高叶片中的花色素苷的含量。 5、彩叶草MYB R2R3家族转录调控因子（SsMYB2和SsMYB3）的克隆及其在烟草中的表达 采用RACE方法，从彩叶草中首次克隆了两个MYB R2R3家族转录调控因子SsMYB2和SsMYB3的全长cDNA序列和对应基因组序列（SsMYB2 Genbank登录号分别为EF522160和EF522161；SsMYB3 Genbank登录号分别为EF522163和EF522164）。两个SsMYB基因各含有1个内含子，符合标准的GT-AG剪接方式。SsMYB2基因组全长1108bp，cDNA全长994bp（不含polyA），含有一个732bp的ORF，编码243个氨基酸。SsMYB3基因组全长931bp，cDNA全长826bp（不含polyA），含有一个747bp的ORF，编码248个氨基酸。NCBI保守域搜索表明，SsMYB2蛋白和SsMYB3蛋白在N-端都含有两个典型的R2R3 MYB DNA结合结构域。SsMYB2蛋白与葡萄VvMYB4（ABL61515）同源性最高，全长一致性是75.0％而R2R3保守结构域一致性是98.1％。SsMYB2 N-端R3保守结构域含有一个保守的bHLH基序（[D／E]Lx2[R／K]x3Lx6Lx3R），非保守C-端具有与功能相关的保守的C1基序（LlsrGIDPxT／SH RxI／1），C2基序（pdLNLD／ElxiG／S）和锌指结构(CX1-2CX7-12CX1-2C)，其中C2基序可能涉及到了目的基因的表达抑制。在系统进化树中，SsMYB2与AmMYB308聚为一小支，与AtMYB4和FaMYB1聚为一大组，属于MYB R2R3家族第4亚家族，其功能可能与苯丙氨酸代谢途径的木质素合成抑制有关。SsMYB3蛋白同源性最高的是葡萄VvMYBPA1（CAJ90831），全长一致性是59％，其中与R2R3部分的一致性高达82.9％。SsMYB3蛋白N-端R3保守结构域中也含有一个保守的bHLH基序，但非保守C-端不具有保守结构，系统进化树中与VvMYBPA1聚为一小支，与ZmP和AtMYB12构成一组，其功能可能与参与类黄酮某一支路的代谢调控，如原花色素或黄酮醇途径的调控。 半定量RT-PCR分析表明，在红色彩叶草中，SsMYB2基因在根、茎、叶和花中都有表达，其中在叶和花中表达较强，而在根和茎中表达较弱。在白光诱导下SsMYB2表达上调，并且在弱光处理前，就能检测到SsMYB2基因的弱表达。干旱胁迫下SsMYB2表达下调，比对照减小约1／3。SsMYB3基因在茎、叶和花中都有表达，其中在叶中表达较强，在根中未检测到表达。白光能诱导条件下SsMYB3基因表达上调，在1-24h内表达量增加迅速。干旱诱导下SsMYB3基因表达下调。 分别构建了SsMYB2基因和SsMYB3基因的正义表达载体，用于烟草的遗传转化研究。超量表达SsMYB2基因的烟草表型与对照相比，表现出茎的节间变短，生长缓慢，叶变小且颜色较浅，叶面出现明显的白色病变（white lesions）斑块等特征，与超量表达AtMYB4和Am308而使木质素合成相关基因受抑制的烟草表型相似。在检测的13株转基因烟草中，不同株系叶片的总黄酮含量都不同程度的增高，其中有10株显著增加（P＜0.01），最高为对照的3倍。超量表达SsMYB3基因的转基因烟草具有正常的植株形态和生长特征，其叶片颜色与对照无明显差别。转基因烟草叶片总黄酮含量测定结果显示，在检测的17株转基因烟草中，不同转基因株系的叶片总黄酮含量相差较大，其中有12株显著增加（P＜0.01或0.05），最高为对照的3.2倍，3株变化不显著（P＞0.05），2株显著下降（P＜0.05）。这表明在转基因烟草中超量表达SsMYB2基因和SsMYB3基因，能有效调控烟草苯丙氨酸次生代谢的不同途径。 6、彩叶草绿色品种茎与叶的颜色形成与SsDFR基因和SsANS基因的表达水平有关 采用半定量RT-PCR对彩叶草绿色品种的根、茎、叶和花中的SsCHS、SsF3H、SsDFR和SsANS基因的转录水平进行了检测和比较。结果表明，四个基因在花中都表达较强，在根中都不表达，在茎和叶中有不同的表达模式。SsCHS基因表达在叶和花中较高，在茎中较弱。SsF3H基因家族的总体表达在花中最高，叶次之，茎中最弱；两个成员在花中表达也较强，在叶中表达较弱，SsF3H2基因在茎中不表达。SsDFR基因在花中表达较强，在茎中表达很弱，而在叶中未检测到表达。SsANS基因家族总体表达在花中较强，在叶中很弱，在茎中没有检测到表达，其中SsANS1基因在叶中的表达比SsANS2基因强，而在花中的表达比SsANS2基因弱。绿色品种在干旱胁迫处理后，叶和茎都出现了显著的花色素苷的积累而变红。RT-PCR分析表明，这四个基因在诱导变色的叶中都表达上调，其中SsDFR和SsANS基因的表达水平显著增加，干旱胁迫能激活SsDFR和SsANS基因的表达。 由此可知，SsCHS和SsF3H基因家族的转录表达不是引起彩叶草红绿两个品种叶和茎颜色差异的原因。彩叶草绿色品种叶中SsDFR基因的转录失活和SsANS基因家族的表达下调，和茎中SsANS基因家族的转录失活则分别是导致叶片和茎不能正常积累花色素苷而呈绿色的重要原因之一。推测，这可能与绿色品种茎和叶中，分别调控SsDFR和SsANS的不同转录因子发生突变失活有关。