加减逍遥散影响慢性心理应激T2DM小鼠IR机制的研究

目的： 糖尿病是当今社会发病率仅次于心脑血管及癌症的第三类重大身心疾病。我国糖尿病发病率高达9.7%,糖尿病病人接近一个亿,中国成为全球“糖尿病第一大国”。糖尿病中90%以上为T2DM, T2DM及其相关并发症已成为威胁人类身心健康的重大问题。从糖尿病的病因研究来看,现代新的医学模式生物---心理---社会医学模式认为,糖尿病是一种心理和身体相关的心身疾病,心理应激是糖尿病的一个重要的诱发因素,而且社会心理因素越来越为人们重视,而这与中医理论中的“情志致病”理论相合。 T2DM中80%以上存在胰岛素抵抗(IR)。IR是T2DM的主要发病机制之一,伴随着T2DM发生、发展的全过程,同时也是肥胖、高血压和血脂异常等多种代谢疾病的重要病理基础。但引起IR的病理机制十分复杂且目前尚不十分清楚。因此研究IR,特别是从中西医结合的方向来研究IR的发生机制,不仅能够丰富中西医的理论,还能对各种代谢性疾病有一定的预防和治疗的作用。 本研究根据糖尿病的临床特点以及中医有关“情志病因最先伤肝”的理论,提出糖尿病的基本病机是脾失健运、不能化精,情志内伤,木失疏泄,土虚木乘是糖尿病发展的重要诱因的假说。以心理应激自发性糖尿病小鼠为研究对象,采用病理学、分子生物学等现代实验技术,从糖代谢及相关基因变化探讨心理应激影响T2DM小鼠IR的机理及中药复方加减逍遥散的作用机制,为中医药防治糖尿病探索新的途径。 方法： 以自发性糖尿病雄性小鼠,高糖高脂饲料喂养连续8周以复制T2DM小鼠模型,通过电击、夹尾、禁食、禁水、合笼饲养等方法复制慢性心理应激模型。观察加味逍遥散对慢性心理应激T2DM小鼠血液生化指标的影响；加味逍遥散对慢性心理应激T2DM小鼠相关基因表达的影响；加味逍遥散对慢性心理应激T2DM小鼠GR表达的影响以及加味逍遥散对慢性心理应激T2DM小鼠IRS-1表达的影响。 结果： 1加味逍遥散对慢性心理应激T2DM小鼠血液生化指标的影响 与空白对照组(WC组)比较,应激组(SC组)的空腹血糖(FBG)有所升高，而糖化血红蛋白(HbAlc)明显升高,胰岛素敏感性指数(ISI)明显降低,体重明显下降,甘油三酯(TG)、总胆固醇(TCHO)明显升高,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)明显降低,XYS组TG、CHO、LDL-C降低,HDL-C显著升高；与SC组比较,应激加逍遥散低剂量组(S+LXYS组)及应激加逍遥散高剂量组(S+HXYS组)的FBG有下降的趋势,而HbAlc则明显下降,S+HXYS组体重明显升高,TG, CHO, LDL-C明显降低,HDL-C明显升高。 2加味逍遥散对慢性心理应激T2DM小鼠相关基因表达的影响 在89个相关基因中,与WC组相比较,SC组表达上调的基因有FOXC2、Ifng、IL-10、 Sell、lc2a4、Tnf及Ucp2等7个,下调的基因有Aqp2、cr2、FOXgl、FOXP3、fkfb3、 Tnfrsflb等6个；XYS组上调的基因有Adral-α、FOXC2、Ifng、Neurod1、Nsf. Pparg. Slc2a4、Gusb等8个,下调的基因有Aqp2、Pfkfb3、Tnfrsflb等3个。与SC组相比较,S+LXYS组上调的基因FOX P3、Ppargcla等2个,下调的基因有Ace. IL-10. Slc2a4. Aktb等4个；S+HXYS组上调的基因有Acly. Adral-α、Aqp2、PP4、Fbp1、G6PC、Gpd1、 Icam1、IgfbpS. IL-4ra等37个,下调的基因有Adra3-β、GIPlr、Vegfa、Actb、Snap25、Pax4等6个。 3加味逍遥散对慢性心理应激T2DM小鼠GR表达的影响 3.1各组小鼠胰岛细胞内GR表达差异 从形态学特征分析,SC组胰岛部位荧光强度最强,且与周围胰腺组织边界清晰；其次是WC组,但其荧光强度与周围胰腺组织反差较小；再其次为S+LXYS组及S+HXYS组；荧光强度最小的是XYS组。从统计数据分析：与WC组相比较,SC组小鼠胰岛细胞内GR表达明显上升,XYS组则明显下降；与SC组相比较,S+LXYS组与S+HXYS组胰岛细胞内GR均明显降低。 3.2各组小鼠肝细胞内GR表达差异 从形态学特征分析,各组小鼠肝细胞GR表达所显示出的荧光强度依次为WC组、S+HXYS组、XYS组、S+LXYS组及SC组。各组小鼠肝组织的微观结构存在较大差异,WC组肝细胞结构完整,但排列不太规则,放射状肝索结构不明显,细胞体相对较大,XYS组肝组织细胞排列比较规则,可见明显的放射状肝索结构,而SC组的肝细胞排列较乱而稀疏,并有许多空泡状结构；S+LXYS组与S+HXYS组在肝细胞数目与排列上均有所恢复,但以S+HXYS组更明显。从统计数据结果分析：与WC组相比较,SC组与XYS组小鼠肝细胞内GR表达明显下降；与SC组相比较,S+LXYS组肝细胞内GR有所上升。而S+HXYS组则明显上升,但S+LXYS组及S+HXYS组均明显低于WC组。 4加味逍遥散对慢性心理应激T2DM小鼠工RS-1表达的影响 4.1各组小鼠胰岛细胞IRS-1表达比较 经DAPI复染后,荧光显微镜下可以清晰分辨各组小鼠胰岛细胞分布,WC组与SC组小鼠胰岛细胞分布相对稀疏,绿色荧光较弱,XYS组、S+LXYS组及S+HXYS组荧光强度较高。从统计数据结果分析也进一步证实：与WC组相比较,SC组IRS-1表达下调,XYS组IRS-1表达上调：与SC组相比较,S+LXYS组与S+HXYS组IRS1表达上调。 4.2各组小鼠肝细胞IRS-1表达比较 从各组小鼠肝细胞免疫荧光及DAPI复染图片比较发现：WC组及SC组小鼠肝细胞排列较乱而稀疏,肝索结构不清晰,细胞核也大小不一,可能是肝细胞死亡后代偿性再生出一些新的细胞,绿色荧光较弱：XYS组及S+HXYS组肝细胞排列较整齐,肝素结构比较清晰,绿色荧光较强,S+LXYS组则介于二者之间。从统计数据也进一步显示：与WC组相比较,SC组肝细胞内绿色荧光强度降低,XYS组的绿色荧光强度增大；与SC组相比较,S+LXYS组绿色荧光稍有增强,而S+HXYS组绿色荧光显著增强。 结论： 1慢性心理应激能加重T2DM小鼠的高血糖病情,降低其胰岛素的敏感性,升高其血清中的TG、CHO,降低HDL-C,使小鼠的体重相对减轻；加味逍遥散一方面具有降糖作用,对T2DM具有较好的治疗效果,另一方面也能对抗慢性心理应激所致的血糖升高,增加胰岛素的敏感性,降低T2DM小鼠血清中的TG、CHO、LDL-C,升高HDL-C,并且减轻应激对小鼠血脂及体重的影响。其作用机制可能是通过提高胰岛素的敏感性从而纠正了T2DM小鼠糖脂代谢的紊乱。 2由于T2DM遗传背景的多样性及异质性,目前对多基因遗传性疾病,尚缺乏正确、全面、合适的技术策略以及家系遗传和疾病的连锁分析法。本实验选择了89个T2DM相关基因,采用PCR芯片技术研究探讨慢性心理应激对T2DM小鼠IR的影响及加减逍遥散的作用机制。结果发现：与WC组相比较,SC组上调的基因有7个,下调的基因有6个；XYS组上调的基因有8个,下调有3个。SC组与XYS组均上调的基因有FOXC2、Ifng、Slc2a4等三个,均下调的基因有下调的基因有Aqp2、Pfkfb3、Tnfrsflb等3个。因此,慢性心理应激可能是通过调节T2DM多种相关基因表达,加重了IR;而加减逍遥散能够对T2DM具有防治作用以及改善IR,也与其调节T2DM相关基因表达密切相关。 3慢性心理应激可使T2DM小鼠胰岛细胞内的GR表达上调,而加减逍遥散则可降低T2DM小鼠胰岛细胞内GR的表达,对于慢性应激模型下的T2DM小鼠而言,S+LXYS组与S+HXYS组均能降低其GR在胰岛细胞中的表达,且S+HXYS组的效果优于S+LXYS组。但对于肝细胞而言,SC组的GR表达反而下降,这可能是与长期慢性应激导致部分肝细胞坏死有关,S+LXYS组与S+HXYS组的GR表达有所回升,且S+HXYS组上升更明显,说明加味逍遥散能对抗慢性心理应激对肝细胞的损伤。 4慢性心理应激能导致T2DM小鼠胰岛细胞及肝细胞内IRS-1表达下调,而加减逍遥散能上调T2DM小鼠胰岛细胞及肝细胞内IRS-1表达,这与第二节的实验中IRS-1基因表达RT-PCR(?)勺结果相一致。说明抑制IRS-1在胰岛β细胞的表达,减少胰岛素的分泌，以及抑制IRS-1在肝细胞的表达,降低肝糖元的合成可能是慢性心理应激加重T2DM小鼠IR的重要机制,而加减逍遥散则可能是通过促进胰岛β细胞及肝细胞内IRS-1的表达,促进胰岛素的分泌及其生物利用度,加快肝糖元的合成而发挥降低血糖,缓解IR的功效。