本论文由五部分组成：第一部分对炎症及其相关的内容进行了简单的概述；第二部分对天然产物库的部分化合物和药用植物的粗样进行LPS诱导RAW264.7产生NO的抑制活性筛选；第三部分对异戊烯基黄酮neougonin A的抗炎作用与抗炎机制进行探讨；第四部分对滇紫草的粗样及其馏分进行NO抑制活性评估指导分离工作,并对分离得到的具有显著NO抑制活性的单体化合物shikonofuran E进行抗炎活性评价与抗炎机理研究；第五部分对全文作出总结。天然产物库是由本课题组从多种药用植物中分离得到的类型多样的单体化合物组成；药用植物的粗样是干燥的药材经粉碎浸提后,先后经石油醚、乙酸乙酯等萃取,再对各相组分经柱层析划分为不同的段位。天然产物的抗炎作用已被广泛的报道,本论文旨在从包含黄酮类、三萜类、二萜类、单萜类、木脂素类等的天然产物库中发现更多具有潜在抗炎活性化合物；对药用植物粗样的筛选可以增强分离工作的选择性,使分离更有效,更有意义。通过对125个单体化合物的筛选,发现其中9个化合物具有较好的抑制NO生成作用,分别是化合物57(17.1μM)、60 (3.3μM)、61 (16.6μM)、68 (2.0μM)、69(3.8μM)、70 (10.9μM)、 72(10.6μM)、94(18.8μM)、106(14.2μM)，阳性对照L-NMMAICso=17.4μM;其中前三个为异戊烯基黄酮,68、69、70、72为丹参酮类二萜,94为双四氢呋喃型木脂素；经构效关系分析,发现在黄酮类、丹参酮类、三萜类、木脂素类化合物中,当疏水性基团异戊烯基、甲氧基、乙酰基、丙酰基的引入或数量的增多都会增强化合物的NO抑制活性；而当亲水性的糖基、羟基的取代或数量增多则会钝化这一抑制活性。对乌饭树和金刚纂粗样的筛选发现乌饭树的石油醚相(VBP)和乙酸乙酯相的小极性段位(VBE4)具有较好的NO抑制作用,IC50分别为25.2,30.9μg/mL;而金刚纂的乙酸乙酯相(ENE)的活性好(16.6μg/mL),且乙酸乙酯相经MCI CHP20/P120划段后,75-90%甲醇/水馏分ENE1与2活性大于另外两段(0.4,8.6μg/mL),进一步追踪,ENE1经硅胶柱层析所得到的馏分对NO的生成抑制作用都很明显(IC50从1.4到14.1μg/mL),总之金刚纂乙酸乙酯相的75-90%甲醇/水馏分值得深入分离。Neougonin A是从七指蕨中分离得到的异戊烯基黄酮,经NO抑制活性筛选发现其活性较佳(ICso=3.3μM),为了进一步明确neougonin A的抗炎作用与抗炎机制,做了本部分的实验考察。先是通过ELISA法考察neougonin A对LPS活化RAW 264.7释放炎症因子的影响,结果显示当neougonin A预处理浓度大于1.25gM时,PGE2、TNFα、IL-1β、IL-6的释放量被显著抑制(P<0.001)；进一步的Westren Blot实验显示neougonin A通过抑制IκBα的磷酸化抑制了NF-κB信号通路的活化,而MAPKs信号转导没有受到明显影响；后通过免疫荧光染色确定neougonin A是通过抑制NF-κB信号通路的活化,阻断核因子p65的转位入核,进而抑制炎症因子(TNFα、IL-1β、IL-6等)和炎症相关蛋白酶(COX2、 iNOS)靶基因的表达。综上,这些结果显示了neougonin A在炎症反应中的调节作用,对neougonin A的开发具有重要意义。滇紫草常作为紫草的代用品,而紫草是复方紫草油(膏)的主成分之一,具有清热凉血、活血解毒、透疹消斑之功效。为了明确滇紫草为什么可以作为紫草的代用品,以及其发挥抗炎活性的物质基础。本实验对滇紫草进行了系统的活性追踪,从滇紫草中分离得到8个具有NO抑制活性的化合物(IC50:0.4-16.5μM),占所得化合物的72%,具有很高的命中率；且这8个化合物中有7个为萘醌类,说明萘醌类化合物是滇紫草发挥抗炎活性的主要物质基础。对化合物shikonofuranE (IC50=3.5μM)深入的抗炎活性与作用机制评价,结果显示化合物shikonofuran E不仅抑制了LPS诱导的RAW 264.7细胞MAPKs信号通路的活化,而且对NF-κB信号通路也有限制作用,正因此,LPS活化RAW 264.7产生炎症因子(PGE2、TNFα、IL-1β、IL-6)的量发生显著的下降(shikonofuran E大于2.5gM时,P<0.05),炎症反应得到控制。
