烟粉虱对高效氯氰菊酯和阿维菌素抗性的生化和分子机理

一、烟粉虱生物型鉴定 利用西葫芦接虫法、酯酶同功酶电泳和线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ（mtDNACOⅠ）基因序列比较等方法对南京（NJ）品系烟粉虱生物型进行了鉴定。NJ品系烟粉虱接种西葫芦后能诱导西葫芦产生银叶症状，其酯酶同功酶谱与Q型烟粉虱明显不同，mtDNA COⅠ基因片段序列与B型烟粉虱同源性达98％以上，这些结果说明NJ品系的生物型为B型。 二、烟粉虱钠通道基因克隆与抗性相关突变检测 通过RT-PCR克隆了烟粉虱钠离子通道结构域ⅡS4-6cDNA片段，发现位于925位亮氨酸到异亮氨酸的突变（L925I）与拟除虫菊酯抗性相关，并建立了L925I突变的PASA检测技术。与SUD-S敏感品系相比，NJ品系对高效氯氰菊酯有266倍的抗性，采用高效氯氰菊酯对该种群进行多次筛选后获得NJ-R1品系，对高效氯氰菊酯的抗性提高到785倍。PASA检测结果表明NJ-R1品系中100％个体都具有L925I突变（61.1％的个体为L925I突变纯合子，38.9％的个体为杂合子），而未筛选的NJ品系只有75％个体具有L925I突变（35％个体为L925I突变纯合子，40％的个体为杂合子，25％的野生型），该结果表明烟粉虱钠离子通道L925I突变与其对高效氯氰菊酯的抗性密切相关。 三、Kdr突变和代谢酶在B型烟粉虱对高效氯氰菊酯抗性中的相对作用 NJ品系对高效氯氰菊酯有266倍的抗性（与SUD-S品系相比）。通过对NJ品系进行群体筛选和单对交配筛选分别获得NJ-R1和NJ-R2品系，其对高效氯氰菊酯的抗性分别达到785和2634倍。增效试验表明PBO对这三个品系的增效作用均为20倍左右，因为在烟粉虱中PBO即是多功能氧化酶抑制剂，也是酯酶抑制剂，而谷胱甘肽S-转移酶与抗性无关，因此推断代谢酶在B型烟粉虱对高效氯氰菊酯的抗性发展中起到的相对作用可能为20倍左右，而且这种抗性是B型烟粉虱天生的；TPP（酯酶的专一性抑制剂）对NJ品系的增效作用为12倍，说明PBO增效作用主要是由于抑制酯酶而引起的，即代谢抗性大部分由酯酶所贡献。在解除代谢酶的作用后（通过PBO处理），NJ-R2、NJ-R1和NJ三个品系对高效氯氰菊酯的抗性分别为149，40和14倍，这部分抗性由kdr突变所贡献．这一结果说明kdr突变频率是B型烟粉虱对拟除虫菊酯抗性水平的决定因子，因为NJ-R2品系为L925I突变纯合子，所以推测kdr突变的最大贡献可达约150倍． 四烟粉虱对阿维菌素的抗性筛选和抗性生化机理 采用群体筛选方法，用阿维菌素对采自南京地区的B型烟粉虱品系（NJ）连续筛选18代后获得一个对阿维菌素具有14.5倍抗性的品系（NJ-Abm）．NJ-Abm对锐劲特没有交互抗性，对吡虫啉和阿维菌素类似物-甲氨基阿维菌素苯甲酸盐分别有3.4倍和4.4倍的交互抗性．与NJ品系相比，NJ-Abm品系的多功能氧化酶和谷胱甘肽S-转移酶活性分别提高了2.1和2.0倍．增效剂PBO和DEM对NJ-Abm品系分别有3.9和4.1倍的增效作用，对NJ品系的增效作用分别为1.6和1.3倍，TPP对两个品系都没有增效作用．这些结果说明多功能氧化酶和谷胱甘肽S-转移酶活性上升是烟粉虱NJ-Abm品系对阿维菌素产生抗性的主要原因． 五烟粉虱谷氨酸受体基因cDNA的克隆和序列分析 采用RT-PCR和RACE技术，首次获得B型烟粉虱谷氨酸受体α亚基cDNA全长序列，将该基因命名为BtGluCla1．BtGluCla1cDNA序列长1353bp，编码450个氨基酸．Blast基因树显示BtGluCla1与果蝇谷氨酸受体α亚基同源性最高（81％，NP732447），与昆虫谷氨酸受体α亚基亲缘关系较近，与线虫谷氨酸受体亚基亲缘关系较远．Expasy蛋白质功能区分析结果表明，BtGluCla1亚基包括一个配基结合位点，九个磷酸化位点和构成半胱氨酸环的四个半胱氨酸残基位点；TMHMM压跨膜区预测结果表明BtGluCla1亚基有四个靠近C端的跨膜区．比较敏感（NJ）和抗性（NJ-Abm）品系BtGluCla1cDNA序列，发现在NJ-Abm品系中存在8个氨基酸多态性位点，NJ品系中只有3个．另外，在NJ和NJ-Abm品系中均存在一个缺失跨膜区Ⅳ的谷氨酸受体基因，命名为dBtGluCla1．在NJ品系cDNA中dBtGluCla1出现频率为20％，在NJ-Abm品系cDNA中dBtGluCla1出现的频率大于80％。单头烟粉虱成虫BtGluCla1基因组DNA序列分析表明，BtGluCla1和dBtGluCla1由不同的基因编码，由此推测抗性和敏感品系dBtGluCla1出现频率的差异可能是这两个基因相对表达量的不同而造成的．