抗炎消瘿方治疗自身免疫性甲状腺炎机理的研究

自身免疫性甲状腺炎(Autoimmune thyroiditis, AT),或称为慢性淋巴细胞性甲状腺炎。研究发现可能是遗传、内分泌、高碘、物理化学等多种因素共同作用,使患者免疫功能发生紊乱,从而产生一系列针对甲状腺组织的自身抗体,导致甲状腺呈弥漫性淋巴细胞浸润,纤维化,间质萎缩及腺泡细胞的嗜酸性改变。桥本策对本病1619例的统计,发现除甲状腺肿大之临床病理表现外,全身乏力乃是其首要的主要症状相一致。本病的病理本质乃是本虚标实。因此本病治标以抗炎为主及减少炎性细胞的侵润,治本以化瘿为主及抑制自身免疫应答和抗体的表达。 传统中药雷公藤、麻黄均具有免疫抑制作用,可以不同程度的抑制淋巴细胞对抗原的反应,从而减轻自身免疫损伤。桃仁配合肉桂,对早期气虚血瘀病症具有活血化瘀温补阳气的功效。临床应用发现对自身甲状腺炎患者有一定的治疗作用。前期实验也分别发现麻黄多糖和雷公藤多种成分可以降低甲状腺抗体的表达,具有抑制亢进的免疫应答的作用。 在此基础上,我们根据配伍原则将四药合参组成抗炎消瘿方,观察其对自身甲状腺炎抗体和激素表达、淋巴细胞及其亚群的水平及甲状腺细胞凋亡诱导因子的影响。同时探讨药物作用机理,为配伍用药提供依据。 整个研究分四个部分 第一部分研究多点注射抗原加高碘致实验性自身免疫性甲状腺炎(EAT)模型的建立。将18-22g小鼠随机分为正常组和模型组。模型组每只小鼠于皮下多点注射含猪甲状腺球蛋白(PTg)完全弗氏佐剂抗原共0.2ml,连续2周,每周一次。第3周起每只小鼠皮下注射PTg不完全弗氏佐剂抗原0.2ml,连续3周,每周一次。每天饮用高碘水。实验中观察小鼠一般状态,记录体重和摄食量变化。实验结束时取甲状腺组织,在光学显微镜下观察小鼠甲状腺病理组织学变化情况。留取血清样本放免检测甲状腺抗体和激素的水平。结果：从第二周开始,模型组摄食量降低,实验从第四周起,模型组动物体重下降,逐渐消瘦,活动减少,突眼,毛发竖立。实验末,模型组小鼠体重和摄食量严重下降。病理检查结果显示,模型组大部分甲状腺呈现不同程度的腺泡扩张,腺泡腔内胶质稀薄,部分腺泡破坏,腺泡及间质可见明显淋巴细胞浸润,严重者形成淋巴滤泡,可见较多嗜酸性粒细胞浸润。放免检测结果,模型组血清激素和抗体水平升高。实验结果提示,多点注射抗原加高碘可导致血清中以TGAb和’TMAb为代表自身抗体高滴度表达：甲状腺组织中滤泡上皮细胞嗜酸性变、坏死及大量淋巴细胞浸润,可见淋巴滤泡并伴有生发中心形成,同时造成类似甲抗症状,如消瘦,活动减少,突眼,毛发竖立等,与临床上AT极为相似。可作为一种有效的EAT模型,用于评价相关药物的作用。 第二部分研究抗炎消瘿方对EAT小鼠激素及抗体水平的影响。第一节中采用多点注射抗原加高碘法造模,同时各给药组按10mg/kg体重灌胃给药,观察抗炎消瘿方对小鼠甲状腺组织的影响。结果：抗炎消瘿方能够修复大部分甲状腺组织,减少淋巴细胞侵润。第二节用放免法检测了抗炎消瘿方对EAT小鼠血清甲状腺激素和抗体的影响。实验结果显示：模型组T3、T4、FT3、FT4、TGA、TMA水平都高于正常组,有显著性差异(p<0.01)。抗炎消瘿方大剂量组T3、T4、FT3、FT4、TGA、TMA水平都低于模型组,有显著性差异(p<0.01,p<0.05)。抗炎消瘿方小剂量组T3、T4、FT3、FT4、TGA、TMA水平低于模型组,但无显著性差异,所以我们认为抗炎消瘿方治疗EAT疗效和药物剂量成一定的相关性。 第三部分研究抗炎消瘿方对EAT小鼠淋巴细胞的影响。第一节用MTT法检测抗炎消瘿方对多点注射抗原加高碘法致自身免疫性甲状腺炎小鼠脾细胞增殖的影响,实验结果显示：EAT模型组脾淋巴细胞的增殖反应显著性高于正常对照组,治疗组能显著性抑制ConA诱导脾淋巴细胞的增殖反应。第二节通过流式细胞仪观察抗炎消瘿方对多点注射抗原加高碘法致EAT小鼠淋巴细胞亚群CD4+/CD8+的影响,实验结果显示：模型组CD4+淋巴细胞/CD8+淋巴细胞高于正常组,有显著性差异(p<0.01),说明模型组淋巴细胞亚群数量异常及平衡失常。治疗组CD8+淋巴细胞高于模型组,有显著性差异(p<0.01)；CD4+淋巴细胞/CD8+淋巴细胞低于模型组,有显著性差异(p<0.01),说明抗炎消瘿方可以提高CD8+淋巴细胞相对含量,降低CD4+淋巴细胞/CD8+淋巴细胞比值,使过激应答的免疫系统得到有效控制。 第四部分研究抗炎消瘿方对EAT小鼠甲状腺细胞凋亡的影响。第一节用免疫组化的方法检测抗炎消瘿方对多点注射抗原加高碘法致EAT小鼠甲状腺组织血管内皮因子(VEGF)的影响。实验结果显示,EAT模型小鼠甲状腺组织VEGF高于正常对照组但没有显著性差异,治疗组使得VEGF表达趋于正常,可以抑制组织内微血管的形成。我们认为这和EAT模型甲状腺组织淋巴滤泡形成,而VEGF高表达又进一步促进组织内微血管的形成有关,但其微血管形成的程度又有别于另一自身甲状腺疾病Graves,认为可以作为区别两种疾病的一种方法。第二节用免疫组化的方法检测抗炎消瘿方对多点注射抗原加高碘法致EAT小鼠甲状腺组织中细胞凋亡因子Fas和其配体Fas-L的影响,实验结果显示,EAT模型小鼠甲状腺组织中细胞凋亡因子Fas和其配体Fas-L呈现高表达,Fas/Fas-L表达增加诱导甲状腺细胞凋亡,产生自身免疫现象。治疗组可显著性降低Fas/Fas-L的高表达,从而抑制细胞凋亡到达治疗自身免疫性甲状腺炎的作用。 结论：多点注射抗原加高碘法是成功的,可作为一种有效的EAT模型,用于评价相关药物的作用。抗炎消瘿方可以改善EAT小鼠的状态,纠正甲状腺激素和抗体水平,抑制淋巴细胞增殖,平衡CD4+淋巴细胞和CD8+淋巴细胞的比例,降低甲状腺组织中VEGF和Fas/Fas—L的高表达。