大鼠损伤脊髓提取液对胚胎大鼠神经干细胞增殖能力及Notch1、Hes1表达的影响

目的：探讨损伤脊髓提取液对胚胎大鼠神经干细胞（Neural Stem Cell，NSC)增殖能力及Notch1、Hes1mRNA表达的影响。方法：分离15天胚胎SD大鼠大脑，在含生长因子的无血清培养基中进行原代培养后传代。取传至第五代的细胞，用免疫荧光染色法鉴定其BrdU、Nestin及被5%胎牛血清诱导分化后NF200、GFAP的表达。将15只健康成年SD雌性大鼠随机分为三组，每组5只。瘫痪组按WD法制作SD大鼠T9平面完全性截瘫的脊髓损伤动物模型。假手术组在相同节段只行椎板开窗。正常组不行手术处理。制模后5天提取各组脊髓提取液。将经鉴定后的神经干细胞随机分为四组：A组空白对照组（NSC+PBS液），B组正常组（NSC+正常脊髓提取液），C组假手术组（NSC+假手术脊髓提取液）及D组瘫痪组（NSC+瘫痪脊髓提取液）。共同培养后1、2、3、4、5天，用MTT法检测各组NSC的增殖能力。共同培养后24、48小时后提取各组NSC的总RNA，用RT-PCR法检测NSC内Notch信号途径的关键基因Notch1与Hes1的表达水平。各项指标用x±s表示，采用SPSS11.5统计软件行单因素方差分析，P<0.05为有统计学意义。结果：胚胎大鼠大脑源性细胞在含生长因子的无血清培养基中能够大量增殖并形成悬浮的球状聚集物，并且能够连续传代。传至第5代的细胞的BrdU及Nestin免疫荧光染色均表现为阳性。5%胎牛血清诱导分化5d后表现为NF200、GFAP免疫荧光染色阳性。各组MTT值（OD）：共同培养1天：A组0.1317±0.0250，B组0.1424±0.0331，C组0.1487±0.0303，D组0.1939±0.1613；共同培养2天：A组0.1860±0.0187，B组0.1813±0.0324，C组0.1855±0.0311，D组0.2384±0.0353；共同培养3天：A组0.2378±0.0288，B组0.2452±0.0310，C组0.2276±0.0273，D组0.2911±0.3306；共同培养4天：A组0.2865±0.0238，B组0.2806±0.0337，C组0.2970±0.0197，D组0.3533±0.0274；共同培养5天：A组0.3224±0.0175，B组0.3094±0.0273，C组0.3149±0.0173，D组0.3831±0.0166。在各个时间点，D组的MTT值均显著高于A、B、C组（P<0.05），而A、B、C组之间均无明显差异（P>0.05）。各组Notch1、Hes1mRNA相对拷贝数：共同培养24h：A组0.994±0.024、0.923±0.036，B组0.988±0.032、0.976±0.034，C组0.934±0.053、0.916±0.062，D组1.150±0.036、1.235±0.103；共同培养48h：A组0.914±0.002、0.876±0.015，B组0.905±0.023、0.874±0.012，C组0.878±0.176、0.900±0.031，D组1.226±0.035、1.347±0.054。在各个时间点，D组的Notch1、Hes1mRNA的表达均显著高于A、B、C组（P<0.05），而A、B、C组之间均无明显差异（P>0.05）。D组48小时与24小时的Notch1、Hes1mRNA的表达无明显差异（P>0.05）。结论：（1）胚胎大鼠大脑源性细胞具有分裂、增殖更新及分化为多种类型神经细胞的潜能，同时还表达未分化的原始神经细胞表面标志物（Nestin阳性），符合神经干细胞的鉴定标准；（2）损伤脊髓提取液在体外能够促进神经干细胞增殖；（3）损伤脊髓提取液在体外能够上调神经干细胞Notch1和Hes1mRNA的表达水平；损伤脊髓提取液可能通过激活Notch信号通路参与对NSC的增殖的调控，主要是通过上调Notch1和Hes1的表达来实现的。