ω-3鱼油改善胃肠外营养相关性肝病及其内质网应激机制在细胞水平的研究

目的： 通过培养新生兔原代肝细胞，并建立肠外营养相关性肝病(Parenteralnutrition-associatedliverdisease，PNALD)细胞模型——肝细胞脂肪变模型，研究内质网应激（Endoplasmicreticulumstress，ERS）相关标志蛋白——糖调节蛋白94（GRP94）在新生兔肝细胞的表达变化，探讨GRP94在PNALD发病机制中的作用，并试图在细胞水平揭示鱼油改善PNALD可能的作用机制，为临床预防和治疗PNALD提供新的思路和实验依据。 材料与方法: 母乳喂养7日的新西兰新生兔8只，雌雄不限，饲养于恒温暖箱，温度维持在26～28℃之间，相对湿度40%～60%，全麻下剖腹取肝脏组织，采取I型胶原酶消化法获取肝细胞，并行传代、培养。将原代肝细胞随机分五组（组1、组2、组3、组4、组5），分别以DMEM培养液，0.2%、0.4%、1%、2%的脂肪乳培养肝细胞。在不同的时间点(24h、48h、72h、96h)分别对各组细胞进行油红O染色观察细胞脂肪变情况，同时行MTT法检测细胞活性，以确定建PNALD细胞模型的脂肪乳最适浓度。 另将原代肝细胞随机分成对照组（CON组）、1%鱼油组（A组）、0.4%鱼油组（B组）、1%脂肪乳组（C组）和0.4%脂肪乳组（D组）五组，CON组用DMEM培养液培养，A组用1%-3鱼油脂肪乳培养，B组用0.4%-3鱼油脂肪乳培养，C组用1%脂肪乳培养，D组用0.4%脂肪乳培养。在不同的时间点(24h、48h、72h，96h)分别收集五组细胞通过油红O染色及电镜观察肝细胞脂肪变情况；MTT法检测细胞活性；全自动生化仪检测各时间点（0h、24h、48h、72h）细胞培养液生化指标变化；采用半定量逆转录多聚酶链式反应法（RT-PCR）检测肝细胞ERS相关标识蛋白—GRP94mRNA的表达；采用免疫组织化学技术检测肝细胞GRP94蛋白表达。 结果： 1.原代肝细胞培养：实验共获得肝细胞8.82×105个，台盼蓝染色细胞活率为92.11%。培养4h后细胞开始贴壁，24h后可见90%以上肝细胞已贴壁，8～10d细胞连接成单层。PAS染色后，低倍镜下可见肝细胞有大量红染的糖原颗粒，高倍镜可见下细胞质内密集粉红色糖原颗粒。 2.肝细胞脂肪变造模脂肪乳浓度确定：五组肝细胞4个时间点（24h、48h、72h、96h）五组肝细胞MTT OD值比较均有统计学意义（P﹤0.01）。与组1相比，组5在4个时间点OD值均明显降低，差异有统计学意义（P﹤0.01）；组4仅在96h细胞OD值较组1下降明显（P﹤0.01），其余3个时间点无明显改变（均P﹥0.05）；组2和组3在4个时间点细胞OD值均无明显下降（P﹥0.05）。 3.造模后各组肝细胞形态、活力、超微结构变化：五组肝细胞在培养24h、48h和72h三个时间点MTT OD值无明显改变，差异无统计学意义（P﹥0.05），96h细胞OD值在五组之间比较，差异有统计学意义（P﹤0.01），且C组较CON、A组、B组和D组均明显下降（P﹤0.01）；五组间肝细胞形态、超微结构比较，CON组四个时间点细胞形态正常，细胞间结合紧密，结构完整，A组在24h开始出现少量脂肪变细胞，72h细胞轮廓发生改变、随着时间的延长脂肪变细胞增加，超微结构可见内质网轻微扩张，线粒体数量减少，其内嵴仍较多。B组仅96h出现少量脂肪变细胞，细胞形态、超微结构均未见明显改变。C组24h即可见大量脂肪变细胞，且随着时间的延长，脂肪变细胞增多、程度加重，内质网扩张明显，线粒体呈空泡改变，其内嵴明显减少。D组24h开始出现少量脂肪变细胞，亦随时间延长而增加，超微结构可见内质网轻微扩张，线粒体数量减少，其内嵴未见明显减少。 4.细胞培养液生化指标：三个时间点（24h、48h、72h）培养液生化指标中TBIL、DBIL、ALT、AST、γ-GT、LDH、ALB在五组间比较，差异均有统计学意义（P<0.01），而TP、TG、PA水平在五组间无显著性差异（P0.05）。C组在三个时间点TBIL、DBIL、ALT、AST、γ-GT、LDH均较CON、A、B和D组明显升高（P<0.01），而ALB均明显降低（P<0.01）；CON、A、B和D组TBIL、DBIL、ALT、AST、γ-GT、LDH水平两两之间比较均无明显改变（均P>0.05）。CON、A、B和D组组内比较四个时间点（0h、24h、48h、72h）生化指标中TBIL、DBIL、ALT、AST、γ-GT、LDH、ALB、TP、TG、PA水平均无显著差异（P0.05），而C组TBIL、DBIL、ALT、AST、γ-GT、LDH和ALB均有显著性差异（P<0.01），TP、TG、PA水平则无明显改变（P0.05），且随着时间的延长，TBIL、DBIL、ALT、AST、γ-GT、LDH有显著增高的趋势（P<0.01），ALB则有明显下降的趋势（P<0.01）；与0h比较，24h、48h和72h TBIL、DBIL、ALT、AST、γ-GT、LDH明显增高（P〈0.01），ALB明显下降（P<0.01）；与24h比较，48h和72h TBIL、DBIL、ALT、AST、γ-GT、LDH明显增高（P<0.01），ALB明显下降（P<0.01）；与48h比较，72h培养液生化指标结果得出相同结果。 5. ERS相关标志蛋白GRP94mRNA表达：RT-PCR结果显示，三个时间点（24h、48h、72h）五组肝细胞间GRP94mRNA表达均有显著差异，有统计学意义（P<0.01）。C组肝细胞GRP94mRNA表达较CON、A、B和D组明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）。CON、A、B和D组之间两两比较均无明显改变（P>0.05）。CON、A、B和D组四组组内比较三个时间点GRP94mRNA表达均无显著差异（P0.05）。而C组内各时间点均有显著性差异（P<0.01），与24h相比，48h和72h细胞GRP94mRNA表达明显升高（P <0.01）；与48h数值相比，72h细胞GRP94mRNA表达亦明显升高（P <0.01）。 6．ERS相关标志蛋白GRP94蛋白表达：免疫组织化学结果显示，三个时间点（24h、48h、72h）五组肝细胞间GRP94蛋白表达灰度值均有显著差异，有统计学意义（P<0.01）。C组肝细胞GRP94蛋白表达灰度值较CON、A、B和D组明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）。CON、A、B和D组之间两两比较均无明显改变（P>0.05）。CON、A、B和D组四组组内比较三个时间点GRP94蛋白表达灰度值均无显著差异（P0.05）。而C组内各时间点均有显著性差异（P<0.01），与24h相比，48h和72h细胞GRP94蛋白表达灰度值明显升高（P <0.01）；与48h数值相比，72h细胞GRP94蛋白表达灰度值亦明显升高（P <0.01）。 结论： 1.本实验成功培养了新生兔原代肝细胞； 2.本实验通过不同浓度脂肪乳培养肝细胞，筛选出实验造模的最适脂肪乳浓度，为进一步开展细胞实验研究奠定基础； 3.本实验成功建立了新生兔肠外营养相关性肝病细胞模型——肝细胞脂肪变模型，为进一步研究其发病机制奠定了基础; 4.1%脂肪乳组肝细胞GRP94mRNA和蛋白表达水平均较CON组有显著升高，组内各时间点比较表达呈明显上升趋势，而0.4%脂肪乳组肝细胞则表达无显著变化，提示ERS与PNALD的发生和发展直接相关，且脂肪乳浓度、作用时间与PNALD的发生、发展密切相关； 5.-3鱼油脂肪乳组（A组、B组）肝细胞GRP94mRNA和蛋白表达均较1%脂肪乳组明显降低，而与CON组无差异，提示-3鱼油脂肪乳能预防PNALD发生，并可能是通过抑制肝细胞中ERS相关蛋白——GRP94的表达而起作用。