蒿鳖养阴软坚方影响Nrf2/NQO1信号通路而抑制四氯化碳诱导肝纤维化的作用

肝纤维化（Hepatics fibrosis,HF）,作为所有慢性肝病的共同病理改变,是由各种慢性致病因素如（胆汁淤积、化学毒物或某些代谢性疾病）等,导致以胶原为主要成分的细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）合成增多,但降解减少,合成和降解的失衡,ECM大量异常沉积于肝内而引起的。研究表明肝纤维化病理改变是可逆的,但如果不加以治疗控制,则会发展成不可逆的肝硬化甚至肝癌。肝星状细胞（Hepatic stellate cell,HSC）,作为ECM的主要来源,其活化增殖便成为肝纤维化发生发展的中心环节。本实验选用CCl4（Carbon tetrachloride）作为刺激剂活化HSC,蒿鳖养阴软坚方作为治疗药物。研究目的通过探讨蒿鳖养阴软坚方缓解CCl4肝纤维化引起氧化损伤程度,初步揭示Nrf2/NQO1通路在蒿鳖养阴软坚方抑制肝纤维化发生中的作用。研究方法1、确定采用体外培养人源LX-2细胞株作为研究对象进行体外培养,按照空白对照组、模型对照组、蒿鳖养阴软坚方组,蒿鳖养阴软坚方组+CCl4进行分组,运用MTT法测定LX-2增殖率;运用比色法测定细胞上清乳酸脱氢酶（Actic dehydrogenase,LDH）活性和羟脯氨酸（Hydroxyproline,Hyp）含量。2、确定采用体外培养人源LX-2细胞株作为研究对象进行体外培养,按照空白对照组、模型对照组、CCl4+蒿鳖养阴软坚方组、CCl4+双香豆素+全反式维甲酸（All-trans retinoic acid,ATRA）组+蒿鳖养阴软坚方组、CCl4+ATRA+蒿鳖养阴软坚方组、CCl4+双香豆素+蒿鳖养阴软坚方以及CCl4+莱菔硫烷（Sulforaphane）+蒿鳖养阴软坚方组进行分组,运用MTT法测定LX-2增殖率;运用酶消化法测定细胞上清Hyp含量,运用Western Blot法检测每组α-SMA、Nrf2以及NQO1的表达水平。3、在体内,选取SPF级健康Wistar大鼠作为研究对象,建立CCl4复合因素所致的大鼠肝纤维化模型,分为正常对照组、模型对照组、秋水仙碱组、蒿鳖养阴软坚方高、中、低剂量治疗组,造模时间6周时间完成后,所有大鼠均再继续饲养一周后开始采集样本,每只大鼠均收集一部分肝组织储存在脱水液中待运用比色法测定各肝组织中Hyp含量,提取肝组织蛋白,一部分用于蛋白定量,另外一部分煮沸变性,用于Western blot法检测肝组织Nrf2和NQO1的表达水平,免疫组织化学的方法测定各组大鼠肝内NQO1和Nrf2的表达水平及分布情况。研究结果1、与空白对照组进行比较,模型组和CCl4+蒿鳖养阴软坚方组LX-2增殖率显著增高,差异具有统计学意义（P<0.05）,Hyp含量也明显增高,差异具有统计学意义（P<0.05）;CCl4+蒿鳖养阴软坚方组与模型对照组比较,LX-2抑制率明显增高,差异具有统计学意义（P<0.05）;Hyp含量显著降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;但各组之间LDH活性差异不具有统计学意义（P>0.05）。2、与空白对照组进行对比而言,其余五组LX-2增殖率均显著增高,差异具有统计学意义（P<0.05）,Hyp含量也明显增高,差异具有统计学意义（P<0.05）。CCl4+Sulforaphane组位居其次,该组与CCl4+蒿鳖养阴软坚方组相比,LX-2细胞存活率明显降低（P<0.05）,与CCl4+ATRA+蒿鳖养阴软坚方组和CCl4+双香豆素+蒿鳖养阴软坚方组以及CCl4+双香豆素+ATRA+蒿鳖养阴软坚方组相比,LX-2抑制率明显升高,差异具有统计学意义（P<0.05）,Hyp含量显著降低,差异具有统计学意义（P<0.05）,α-SMA表达水平显著降低,差异具有统计学意义（P<0.05）,Nrf2和NQO1的表达水平呈现出了大幅度的上调,差异具有统计学意义（P<0.05）。3、与正常对照组进行对比而言,模型对照组的Hyp含量明显升高,Nrf2和NQO1的表达水平明显降低,在取组织的过程中,模型组大鼠的腹水与肝纤维化病变均非常严重,说明此次实验建模成功;与模型对照组相比,蒿鳖养阴软坚方三个治疗剂量组的Hyp含量是明显降低的,Nrf2和NQO1的表达水平明显升高,组织肝纤维化病变程度也明显缓解,由此说明,蒿鳖养阴软坚方对于治疗CCl4复合因素诱导形成的大鼠肝纤维化病变有显著疗效。结论1、结合体内和体外实验测定结果显示蒿鳖养阴软坚方均可以通过下调α-SMA表达水平的同时上调Nrf2和NQO1的表达水平,有效地抑制CCl4诱导的LX-2细胞活化增殖,减少Hyp含量。2、蒿鳖养阴软坚方可以通过影响Nrf2/NQO1通路从而上调Nrf2表达水平,进而上调其下游II相解毒酶NQO1的表达水平,有效的抑制LX-2细胞活化增殖,进而控制肝纤维化发生发展。